HPLC測(cè)定退熱解毒注射液中綠原酸和咖啡酸含量

索銀科， 王永平

（1.寶雞市藥品檢驗(yàn)所，陜西寶雞 721001;2.中鐵一局集團(tuán)中心醫(yī)院，陜西華縣 714100）

退熱解毒注射液由金銀花、連翹、牡丹皮、蒲公英、金錢(qián)草、柴胡、夏枯草、石膏共八味藥材組方，具有清熱解毒的功能［1］。綠原酸和咖啡酸具有抗病毒、抗菌、利膽、止血等藥理作用［2］。蒲公英、金銀花中均含有綠原酸和咖啡酸［3，4］，文獻(xiàn)中報(bào)道分析方法較多［5-7］，但尚未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定退熱解毒注射液中的此兩組分。部頒標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法只測(cè)定該制劑中的綠原酸［1］，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了綠原酸和咖啡酸的含量，樣品不需要特殊處理，具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、無(wú)干擾的特點(diǎn)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（單元泵G1310A，VWD 檢測(cè)器 G1314A，7725i進(jìn)樣閥 G1328B，20 μL 定量環(huán)，Agilent Chem Station revision B.02.01-SR1［260］）;TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);綠原酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110753-200413，供含量測(cè)定用）和咖啡酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110885-200102，供含量測(cè)定用）;退熱解毒注射液市售品為陜西某制藥企業(yè)產(chǎn)品3批（批號(hào)080417，080717，080718）;甲醇（HPLC，天津市科密歐試劑有限公司）;重蒸餾水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:0.01 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.9）-甲醇（85∶15）;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):323 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取經(jīng)減壓干燥（真空度0.075 MPa，溫度20℃，干燥劑五氧化二磷）24 h的綠原酸對(duì)照品20.0 mg、咖啡酸對(duì)照品8.0 mg，分別置50 mL量瓶中;用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即分別得濃度為400 mg/L的綠原酸和160 mg/L的咖啡酸對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液制備 取5支注射液，混勻，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方稱(chēng)取除金銀花、蒲公英外各味藥材相當(dāng)10mL量，照退熱解毒注射液生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 方法的專(zhuān)屬性 在擬定的色譜條件下測(cè)定，吸取40 mg/L綠原酸、20 mg/L咖啡酸對(duì)照品溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖見(jiàn)圖1。對(duì)比保留時(shí)間可知，保留時(shí)間為11.325 min和25.013 min分別是綠原酸峰和咖啡酸峰，經(jīng)計(jì)算其理論板數(shù)分別為863和5 276，二者與相鄰峰的分離度為6.34和9.36，陰性樣品溶液色譜圖顯示在綠原酸和咖啡酸峰位置處無(wú)干擾，表明其他組分和輔料不影響對(duì)二者同時(shí)測(cè)定。

圖1 綠原酸對(duì)照品（A）、咖啡酸對(duì)照品（B）、樣品（C）和陰性樣品（D）的HPLC色譜圖

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取400 mg/L綠原酸對(duì)照品溶液0.01、0.1、0.3、1.0、3.0、5.0 mL 和 160 mg/L 咖啡酸對(duì)照品溶液 0.01、0.06、0.6、2.0、5.0、10 mL，依次分別置 10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成表1所示濃度的綠原酸和咖啡酸對(duì)照品溶液，精密吸取上述各溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別以綠原酸和咖啡酸對(duì)照品溶液（X:mg/L）為橫坐標(biāo)與其相應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)得綠原酸、咖啡酸檢測(cè)限（S/N=3）分別為0.013，0.005 mg/L;定量限（S/N=10）分別為0.040，0.016 mg/L。

表1 綠原酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)的退熱解毒注射液樣品溶液，分別在 0、0.5、1、2、4、12 h 時(shí)測(cè)定，結(jié)果綠原酸、咖啡酸的峰面積RSD值分別為1.4%和1.6%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)的退熱解毒注射液樣品溶液，精密量取20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果綠原酸、咖啡酸的峰面積RSD值分別為1.2%和1.4%，表明該方法精密度良好。2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)080417退熱解毒注射液，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液5份，精密量取20 μL，各溶液進(jìn)樣分析2次，以平均峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算，測(cè)得綠原酸和咖啡酸含量分別為1.5 mg/mL（RSD為1.4%，n=5），0.13 mg/mL（RSD為1.7%，n=5）。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取本品1.0 mL，置25 mL量瓶中，分別精密加入表2所示量綠原酸和咖啡酸對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，作供試液。吸取20 μL進(jìn)樣分析2次，記錄色譜圖，以平均峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算，測(cè)得綠原酸和咖啡酸平均回收率分別是99.4%（RSD=1.0%），100.9%（RSD=1.6%）。見(jiàn)表2。

表2 綠原酸和咖啡酸的回收率（n=6）

2.11 樣品含量測(cè)定 取5支注射液，混勻，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試液。精密吸取20 μL進(jìn)樣分析2次，記錄色譜圖，以平均峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中綠原酸與咖啡酸含量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中綠原酸和咖啡酸含量（n=3）

3 討論

3.1 咖啡酸在323 nm處有最大吸收，綠原酸在327 nm處有最大吸收。考慮供試品咖啡酸含量較低，所以選用323 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)下綠原酸吸光度也較大。

3.2 本試驗(yàn)進(jìn)行了兩味藥材陰性對(duì)照試驗(yàn)，證實(shí)此兩味藥之間無(wú)相互干擾。實(shí)驗(yàn)中各樣品均用流動(dòng)相稀釋?zhuān)巳軇┓甯蓴_。

3.3 考察了水-甲醇-乙腈-冰醋酸、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-磷酸鹽緩沖液等流動(dòng)相，最終確定甲醇-磷酸二氫鈉溶液（pH值為3.9）（15∶85），流速:1.0 mL/min，分離效果良好，綠原酸、咖啡酸分別在11 min、25 min左右出峰，保留時(shí)間適中，重復(fù)性好，回收率高，可用于退熱解毒注射液的質(zhì)量控制。

［1］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑［S］.第20冊(cè).1998:250-251.

［2］國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊(cè)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:159-161，209-210.

［3］肖培根，李大鵬，楊世林.新編中藥志［M］.第三卷.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002:363-373.

［4］肖培根，李大鵬.新編中藥志［M］.第五卷.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:988-995.

［5］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:152-153，244-245.

［6］孫國(guó)祥，劉唯芬，朱澄云，等.RP-HPLC測(cè)定射干抗病毒注射液中綠原酸和咖啡酸含量［J］.中成藥，2006，28（7）:962-965.

［7］李喜鳳，師繪敏，陳隨清，等.HPLC同時(shí)測(cè)定蒲公英中綠原酸和咖啡酸的含量［J］.中成藥，2008，30（10）:1553-1555.