玉郎傘多糖對慢性應(yīng)激小鼠不同腦區(qū)腺苷酸環(huán)化酶的影響

梁 霜， 王乃平， 付書婕， 黃仁彬*

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，廣西南寧 530021;2.南寧市第二人民醫(yī)院，廣西南寧 530013）

Wei的塊根中提取的有效成分，本課題組前期研究表明，YLSPS可顯著縮短行為絕望動(dòng)物模型的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，提高腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度，并與α2－腎上腺素受體有關(guān)。現(xiàn)有理論認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)生不僅與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體有關(guān)，還涉及受體后信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。單胺受體后腺苷酸環(huán)代酶（adenylate cyclase，AC）活性對神經(jīng)元保護(hù)和神經(jīng)元再生有著重要的影響。經(jīng)典的抗抑郁藥對腦內(nèi)AC有調(diào)節(jié)作用，并且激活腦內(nèi) cAMP－CREB（cAMP responseelement－binding protein，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）通路，這也被認(rèn)為是抗抑郁藥作用的重要機(jī)制［1，2］。因此，為更深入探討YLSPS抗抑郁作用機(jī)制，本研究采用放射免疫法測定YLSPS對慢性應(yīng)激小鼠不同腦區(qū)AC活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級，♂性，體重（18±22）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號:SCXK（桂）2003－0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 YLSPS，由本室自行提取（玉郎傘經(jīng)醇提后的藥渣用熱水提取，乙醇沉淀，Sevag試劑脫蛋白，采用DEAE纖維素（DEAE－52）柱層析分離純化，分離得到的YLSPS經(jīng)Sephadex－75凝膠柱層析，硫酸－苯酚法以及高效凝膠滲透色譜法證實(shí)為高純度多糖，純度95%，紫外掃描顯示無核酸和蛋白特征吸收峰，薄層色譜和氣相色譜表明由葡萄糖和阿拉伯糖組成，紅外光譜顯示有典型的多糖吸收峰）。實(shí)驗(yàn)前將各試藥用蒸餾水配成所需濃度，4℃冷藏備用。

1.3 儀器與試劑 GC－1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司中佳光電儀器分公司）;TGL－16G－A低溫離心機(jī);FJ－200高速均質(zhì)分散機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）。環(huán)磷酸腺苷放射免疫分析試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號:20081024）。

1.4 方法

1.4.1 慢性應(yīng)激抑郁模型的制備、動(dòng)物分組和給藥 參照大鼠不可預(yù)知的慢性應(yīng)激模型、大鼠慢性不可預(yù)知的溫和性應(yīng)激模型［3］和小鼠慢性應(yīng)激模型［4］建立。將小鼠隨機(jī)分成6組:空白組、模型組、氟西汀組（FLU組）、YLSPS低劑量組（YLSPSL組）、YLSPS中劑量組（YLSPSM）、YLSPS高劑量組（YLSPSH），每組10只。空白組正常飲食水，不給予任何刺激。其余各組均接受21 d的不可預(yù)知慢性刺激。刺激包括:冷水游泳（10 ℃，5 min）、夾尾（1 min）、懸吊30 min、禁水（24 h）、禁食（24 h）、潮濕飼養(yǎng)（將200 mL水加入有鋸末的籠底，24 h）和晝夜翻轉(zhuǎn)。刺激方式以每日1次隨機(jī)交替。

1.4.2 取材和樣品處理 將小鼠斷頭，在冰臺上迅速分離前額皮層、下丘腦、海馬，稱重。取組織50 mg，加入2 mL冷的50 mM pH4.75醋酸緩沖液（27.22 g NaAc·3H2O溶于1 000 mL蒸餾水，即為 0.2 mol/L NaAc。用冰醋酸配制0.2 mol/L醋酸，然后取410 mL 0.2 mol/L HAc和590 mL 0.2 mol/L NaAc混勻，測pH值調(diào)到pH4.75，然后每1 000 mL溶液加入5.95 g EDTA二鈉鹽溶解即得200 mM pH 4.75醋酸緩沖液，用時(shí)1∶4稀釋）的試管內(nèi)（冰浴），勻漿，加入2 mL無水乙醇，混勻，靜止5 min，3 500 r/min冷凍高速離心15 min，將上清液收集在青霉素小瓶內(nèi)，再用75%乙醇2 mL洗沉淀，勻漿分散，混勻，3 500 r/min冷凍高速離心15 min，合并上清液，60℃烤箱中吹干，殘?jiān)庞?℃保存。測時(shí)用1 mL醋酸緩沖液溶解，取0.1 mL測量。

1.4.3 環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的測定 嚴(yán)格按照環(huán)磷酸腺苷放射免疫分析試劑盒要求測定各反應(yīng)管中cAMP產(chǎn)生量。反應(yīng)結(jié)束后，3 000 r/min離心15 min，小心吸去上清液。在γ放射免疫計(jì)數(shù)器上測定沉淀CPM數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cAMP的產(chǎn)生量。

2 結(jié)果

經(jīng)慢性應(yīng)激后，模型組小鼠前額皮層、下丘腦、海馬cAMP產(chǎn)生的量明顯降低，與空白組相比具顯著性差異（P＜0.01）。與模型組組相比，F(xiàn)LU（20 mg/kg）和YLSPA各劑量組（150、300、600 mg/kg）均可增加慢性應(yīng)激小鼠前額皮層、下丘腦、海馬cAMP產(chǎn)生的量（P＜0.01）。結(jié)果提示FLU在20 mg/kg、YLSPS在150～600 mg/kg的條件下可激活慢性應(yīng)激小鼠前額皮層、下丘腦、海馬AC活性。結(jié)果見表1。

表1 YLSPS對慢性應(yīng)激小鼠各腦區(qū)AC活性的影響（±s，n=10）

表1 YLSPS對慢性應(yīng)激小鼠各腦區(qū)AC活性的影響（±s，n=10）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

cAMP/（ng/mL）前額皮層 下丘腦 海馬空白組 － 128.10±9.53▲▲ 84.90±10.10▲▲ 93.10±2.42組別 劑量/（mg/kg）▲▲模型組 － 88.70±4.57** 62.30±3.23** 65.60±8.25**FLU組 20 124.75±4.02▲▲ 83.80±1.99▲▲ 88.00±3.23▲▲YLSPSL 150 101.40±9.24**▲▲ 74.40±4.20**▲▲ 75.90±4.58**▲▲YLSPSM 300 121.00±4.47*▲▲ 79.10±2.16*▲▲ 84.80±1.87**▲▲YLSPSH 600 124.10±5.09▲▲ 84.10±1.91▲▲ 88.40±9.42▲▲

3 討論

抗抑郁藥的作用機(jī)制目前尚不明確，傳統(tǒng)單胺遞質(zhì)理論和受體理論無法充分解釋抗抑郁藥的臨床效應(yīng)滯后現(xiàn)象。目前普遍認(rèn)為抑郁癥發(fā)病不僅限于神經(jīng)遞質(zhì)和受體的改變，還會累及受體后的信號通路。近年來的研究證實(shí)，抑郁患者大腦皮層腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC）活性降低，大腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cAMP信號通路（cAMP signal pathway）功能紊亂［5］。抑郁癥與cAMP信號通路的功能異常密切相關(guān)，經(jīng)抗抑郁劑處理后能逆轉(zhuǎn) AC活性水平低下的狀態(tài)［6］，誘導(dǎo)cAMP 通路代償性增強(qiáng)［7］。

cAMP信號通路又稱PKA（protein kinase A，蛋白激酶A）系統(tǒng)，是環(huán)核苷酸系統(tǒng)的一種。在這個(gè)系統(tǒng)中，細(xì)胞外信號與相應(yīng)受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP的水平而引起反應(yīng)的信號通路。信號分子通常是激素，對cAMP水平的調(diào)節(jié)，是靠AC進(jìn)行的。cAMP通路的激活可能是抗抑郁劑產(chǎn)生治療效果的途徑之一。很多抗抑郁藥物都增加了突觸NE和/或5－HT的濃度，這些神經(jīng)遞質(zhì)與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合（如G蛋白），G蛋白可調(diào)節(jié)AC的活性，AC可大量催化ATP轉(zhuǎn)變成cAMP，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度增高，cAMP作為第二信使進(jìn)一步激活PKA，活化的PKA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，使轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP－responsive element binding protein，CREB）的Ser133位絲氨酸磷酸化，CREB的磷酸化可以實(shí)現(xiàn)對相關(guān)基因的誘導(dǎo)和調(diào)控。研究表明，AC是G蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的酶，AC可能是新型組織及細(xì)胞特異性藥物的作用靶點(diǎn)，抗抑郁劑對cAMP通路的激活具有特異性，因此AC也就成為藥物篩選的相對特異的指標(biāo)之一。

前期研究發(fā)現(xiàn)，YLSPS對行為絕望動(dòng)物模型和慢性應(yīng)激小鼠模型具有顯著的抗抑郁作用，能直接或間接提高慢性應(yīng)激小鼠腦中NE、5－HT、DA含量。為深入探討YLSPS抗抑郁作用的機(jī)制，本研究采用放射免疫方法考察YLSPS對慢性應(yīng)激小鼠不同腦區(qū)AC活性的影響。結(jié)果表明，YLSPS各劑量組能顯著提高慢性應(yīng)激小鼠前額皮層、下丘腦和海馬AC活性。因此，YLSPS影響小鼠前額皮層、下丘腦和海馬AC活性可能是其抗抑郁活性的重要機(jī)制之一。YLSPS在抗抑郁作用中是如何影響不同腦區(qū)AC活性尚需進(jìn)一步研究。

［1］Li Y F，Gong Z H，Cao J B，et al.Antidepressant－like effect of agmatine and its possiblemechanism［J］.Eur J Pharmacol，2003，469:81－88.

［2］Li Y F，Luo Z P.Depression:neuron lesion and neurogenesis down－regulation［J］.Acta Pharm Sin，2004，39:949－953.

［3］Harkin A，Houlihan D D，Kelly J P.Reduction in preference for saccharin by repeated unpredictable stress in mice and its prevention by imipramine［J］.J Psychopharmacol，2002，16（2）:115－123.

［4］Li Y F，Yuan L，Xu Y K，et al.Antistress effect of oligosaccharides extracted from Morinda officinalis in mice and rats［J］.Acta pharmacol Sin，2001，22（12）:1084－1088.

［5］Eric J N，Michel B，Ralph J D，et al.Neurobiology of depression［J］.Neuron，2002，34（1）:13－25.

［6］Hines L M，Tabakoff B.Platelet adenylyl cyclase activity:a biological marker for major depression and recent drug use［J］.Biol Psychiatry，2005，15;58（12）:995－962.

［7］D＇Sa C，Eisch A J，Bolger G B，et al.Differential expression and regulation of the cAMP－selective phosphodiesterase type 4A splice variants in rat brain by chronic antidepressant administration［J］.Eur J Neurosci，2005，22（6）:1463－1475.