遼寧地區斑禿患者與HLA-A、HLA-B等位基因相關性研究

姜海燕，翟寧，李劍平，陳陽，秦玉孝，張悅，程巖峰，楊帆，韓秀萍

（1.中國醫科大學 附屬盛京醫院皮膚科，沈陽 110004；2.中國醫科大學 附屬第一醫院皮膚科，沈陽 110001；3.遼寧省血液中心，沈陽110044；4.鐵嶺市中心血站，遼寧 鐵嶺 112000）

斑禿是一種常見的毛發疾病，發病原因尚不清楚，目前認為可能與遺傳，情緒應激，內分泌失調，自身免疫等因素有關，其中遺傳因素可能起重要作用［1］。關于HLA-A、HLA-B等位基因與斑禿的相關性研究，國外報道較多，國內少有此方面的報道。關于此方面的報道因種族不同，地域不同而有差異。為了探討HLA-A、HLA-B等位基因與遼寧地區斑禿患者的相關性，我們應用LABTypeTMSSO技術（又稱序列微珠綜合實驗系統）檢測了44例遼寧地區漢族斑禿患者和200例正常對照者的HLA-A、HLA-B等位基因頻率。

1 材料與方法

1.1 研究對象

斑禿患者44例，其中男性26例，女性18例，年

齡 3~57歲，平均（25.36±13.23）歲，病程 5 d~86個月，均為中國醫科大學附屬盛京醫院皮膚性病門診確診的遼寧地區漢族斑禿患者，彼此間無血緣關系。正常對照組200例，為彼此間無血緣關系的遼寧籍漢族健康人。

1.2 血液采集與實驗方法

1.2.1 基因組DNA的制備：靜脈抽取受檢者抗凝血2 ml，其中0.5 ml用于DNA制備，其余血液分裝每管0.5 ml后-80℃冷凍保存備用。應用全血基因組DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司產品）提取基因組DNA。嚴格按說明書進行實驗操作。（1）取EDTA抗凝血0.5 ml至1.5 ml離心管中，加入GenTLE SolutionⅠ0.5 ml，震蕩數秒后室溫放置10 min，12 000 r/min，離心 5 min。（2）除去溶液，加入GenTLE Solution Ⅱ 1ml，顛倒混合 2、3 次后，12 000 r/min離心 5 min。（3）除去上清，加入 GenTLESolution Ⅲ 0.5 ml，震蕩 10 s，12 000 r/min 離心 5 min。（4）將上清液移入新的離心管中，與等量的異丙醇混合，充分顛倒混合后，12 000 r/min 4℃離心5 min；（5）除去上清，70%乙醇清洗沉淀物，12 000 r/min 4℃離心5 min后干燥沉淀，用10μl TEBuffer溶解沉淀。（6）純化DNA。將制備的DNA濃度調為0.1μg/μl左右。DNA純度A260/A280比率在1.6~1.9。并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示無DNA降解現象。

1.2.2 HLA分型：HLA-A、HLA-B基因分型采用基于Luminex技術的One Lambda公司PCR-SSO試劑。嚴格按說明書進行實驗操作。（1）等位基因擴增：準備PCR板，每孔加待測DNA 2μl，底物/組特異性引物/Taq聚合酶混合液9μl。PCR循環參數：96℃預變性3 min，96℃變性 20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計5個循環；96℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共計30個循環；72℃延伸10 min。（2）變性及中和：準備96孔板，每孔加擴增后的DNA 2.5μl及變性緩沖液1.5μl，溫室下孵育10 min后加中和緩沖液2.5μl。（3）雜交：每孔加雜交緩沖液（內含包被有SSO探針的磁珠，其中A位點79個探針，B位點86個探針）19μl，60℃孵育15 min后用洗滌液清洗3次。（4）標記：每孔加熒光液25μl，60℃孵育5 min后用洗滌液清洗1次，加60 μl洗滌液，轉到Luminex讀板上。（5）讀板并確定基因型：雜交產物用Luminex100流式微珠自動檢測儀進行結果讀取和分析（流式分析儀，Luminex公司產品），確定基因型。

1.3 統計學方法

應用SPSS17.0軟件分析，采用卡方檢驗對患者組和正常對照組的HLA等位基因進行相關性分析，獲得χ2值及P值。

2 結果

2.1 斑禿患者組與正常對照組HLA-A等位基因頻率比較

斑禿患者組HLA-A*11等位基因頻率較正常對照組明顯增高（10.23%vs 4.00%，χ2=6.08，P=0.01），見表1。

表1 HLA-A等位基因在患者組與對照組中的頻率比較Tab.1 The comparison of HLA-A allele frequencies between the patients with alopecia areata and healthy control

2.2 斑禿患者組與正常對照組HLA-B等位基因頻率比較

斑禿患者組HLA-B*13（12.50%vs 1.25%，χ2=29.80，P=0.00）、HLA-B*40 （12.50%vs 4.75%，χ2=8.04，P=0.01）、HLA-B*46（5.68%vs 1.50%，χ2=5.86，P=0.02）和 HLA-B*51（12.50%vs 4.50%，χ2=8.82，P=0.00）等位基因頻率均較正常對照組顯著增高，見表2。

3 討論

斑禿的病因至今未明。大多數觀點認為它是細胞介導、基因調控的自身免疫性疾病。基因易患性似乎是一個病因，有人認為斑禿可能與HLA基因相關［2］。關于斑禿與HLA相關性研究，國外在此方面的研究比較早。Kavak［3］報道土耳其斑禿患者HLAA1、HLA-B 62（15）等位基因頻率明顯增高。Aliaqaoqlu［4］研究發現土耳其斑禿患者HLA-B 62顯著增多，而 HLA-A*2、HLA-A*24、HLA-B*35 明顯減少，提示 HLA-A*2、HLA-A*24、HLA-B*35 可能是斑禿患者的保護性基因。McDonagh［5］報道以色列人與HLA-B18 相關。Hordinsk［6］和 Nanda［7］分別報道美國和科威特斑禿患者HLA-B*40等位基因頻率明顯增高，這與我們的研究結果相一致。

關于斑禿與HLA-A、HLA-B等位基因的相關性，國內外的檢測結果不盡相同。國內在此方面的研究多選擇不同省籍的漢族斑禿患者作為研究對象。2007年肖鳳麗等［8］發現皖籍漢族斑禿患者HLAA*02、HLA-A*03、HLA-B*18、HLA-B*27 和 HLA-B*52等位基因頻率較正常對照組顯著增高。其結果與國外報道部分相同，而與我們的結果無相同之處。

表2 HLA-B等位基因在患者組與對照組中的頻率比較Tab.2 The comparison of HLA-B allele frequencies between the patients with alopecia areata and healthy control

我 們 研 究 發 現 HLA-A*11、HLA-B*13、HLAB*40、HLA-B*46和HLA-B*51等位基因頻率顯著增 高 。HLA-A*11、HLA-B*13、HLA-B*46 和 HLAB*51是我們新發現的易患基因位點，可能是遼寧地區漢族斑禿患者的易感基因。我們的研究結果與以往的研究有相同之處，說明遺傳因素可能在斑禿的發病中起重要作用，而有差異則考慮可能是地域不同、種族不同所致。通過對斑禿患者與HLA-A、HLAB等位基因相關性的研究，將對揭示斑禿的發病機理及臨床早期診斷具有重要意義。

［1］Kos L，Conlon J.Anupdateon alopeciaareata［J］.Curr Opin Pediatr，2009，21（4）：475-480.

［2］Richard B.Odom，William D.James.Timothy G.Berger.安德魯斯皮膚病學［M］.9版，北京：科學出版社，2001：943-945.

［3］Kavak A，Baykal C，Ozarmagan G，et al.HLA in alopecia areata［J］.Int JDermatol，2000，39（8）：589-592.

［4］Aliaqaoqlu C，Pirim I，Atasoy M，et al.Association between alopecia areataand HLAclassIand Turkey［J］.JDermatol，2005，32（9）：711-714.

［5］McDonagh AJ，Messenger AG.The Pathogenesis of alopecia areata［J］.Dermatol Clin，1996，14（4）：661-670.

［6］Hordinsky MK，Hallgren H，Nelson D，et al.Familial alopecia areata HLAantigensand autoantibody formation in an American family［J］.Arch Dermatol，1984，120（4）：464-468.

［7］Nanda A，Alsaleh QA，Al-Hasawi F，et al.Thyroid functi-on，autoantibodies，and HLA tissue typing in children with alopecia areata［J］.Pediatr Dermatol，2002，19（6）：486-491.

［8］肖風麗，苗國英，張克西，等HLA等位基因與皖籍漢族人群斑禿的相關性研究［J］.安徽醫科大學學報，2007，42（1）：67-69.