同型半胱氨酸誘導的ERK調節作用與上皮生長因子受體的間接激活

楊軍，萬里姝，彭亮，任艷

（中國醫科大學 附屬第一醫院神經內科，沈陽 110001）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸的代謝產物。嚴重的高同型半胱氨酸血癥患者可存在神經系統表現異常。近年來，Hcy的神經毒性越來越引起了人們的重視。研究表明，Hcy水平的升高可能與Alzheimer病相關［1］，也有人認為高同型半胱氨酸血癥可能是老年認知障礙的一個早期標志［2，3］。Hcy引起神經元損傷的機制目前尚不完全清楚，可能與興奮谷氨酸受體，引起氧化反應，DNA修復功能損害［4］有關。

研究發現，在大鼠胚胎皮層神經元等多種細胞及半胱氨酸β合成酶缺陷大鼠海馬切片的同型半胱氨酸毒性試驗中都發現有激活的細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）存在［5］，提示Hcy可能誘導了ERK激活，但其具體機制目前尚不清楚。本研究利用原代培養的CD-1小鼠小腦顆粒神經元，檢測了Hcy誘導下的ERK1/2磷酸化，并觀察了神經細胞ERK上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）特異性抑制劑AG1478能否對其產生抑制，探討了Hcy與EGFR間接激活信號傳導途徑之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

7 d齡CD-1小鼠，體質量約3.6 g，雌雄不限，由中國醫科大學臨床藥理教研室提供。AG1478（Cal－Biochem，美國），抗 ERK、P-ERK 特異性抗體、羊抗鼠 IgGHRP 二抗（Santa Cruz，美國），L-Hcy、碘化丙錠、DMEM、阿糖胞苷（Sigma，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小腦顆粒神經元原代培養：將小鼠置于75℅乙醇中，斷頸后取出腦組織，置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，在解剖顯微鏡下剝離出小腦，用無 Ca2+、Mg2+的 Hank′s液洗滌 2 次，切碎成糊狀，加入0.002%胰蛋白酶，37℃、5%CO2培養箱內孵育2 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液1 500 r/min離心后棄上清，加入DMEM培養液4℃下混勻后過濾，將濾得的細胞加入事先鋪以多聚賴氨酸的平皿中，37℃、5%CO2培養箱內孵育15 min，待小腦顆粒神經元細胞貼壁后，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 1.5 ml。置37℃、5%CO2培養箱內孵育24 h。加入阿糖胞苷（40μmol/L），置37℃、5%CO2培養箱內培養并每日觀察。

1.2.2 分組：將培養7 d的小腦顆粒神經元的培養液換成無血清培養液后，隨機分為4組：（1）生理鹽水對照組：加入生理鹽水培養20 min；（2）AG1478對照組：加入 AG1478（1 mmol/L）培養 20 min；（3）Hcy處理組：加入 Hcy（0.1 mmol/L）培養 20 min；（4）AG1478+Hcy處理組：先加入 AG1478（1 mmol/L）預處理15 min后，再加入Hcy（0.1 mmol/L）培養20 min。

1.2.3 Western blot：收集各組細胞，提取蛋白，Bradford方法進行蛋白定量。取50 mg蛋白行SDS-PAGE電泳，轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入抗p-ERK或ERK一抗于室溫中孵育2 h。PBS洗膜4次。加入羊抗鼠（p-ERK）IgGHRP二抗孵育。ECL顯色成像。用Window AlPhaEase TMFC 32-bit分析軟件進行色帶灰度分析。實驗重復4次，所得結果取均值。

將原代培養7 d的小腦顆粒神經元置于含有Hcy 0.1 mmol/L的無血清培養液中，37℃孵育10、20、40、60 min，采用 Western blot法測定 ERK 磷酸化情況并繪制時間曲線。

1.2.4 流式細胞儀分析細胞凋亡率：各組細胞藥物處理6 h后，將細胞輕輕吹起，1 500 r/min離心后收集細胞。PBS沖洗，再次1 500 r/min離心，棄上清，加入75%乙醇保存過夜。1 500 r/min離心，棄上清，PBS沖洗，1 500 r/min離心后棄上清，加入碘化丙錠（10 mg/ml），37℃孵箱內孵育30 min，流式細胞儀（BD公司，美國）檢測細胞凋亡率。實驗重復4次，結果取均值。

1.3 統計學分析

采用SPSS12.0軟件進行統計學分析。計量資料數據用x±s表示。多組資料用One-Way ANOVA方法進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hcy引起小鼠小腦顆粒神經元ERK磷酸化（圖1）

Western blot結果顯示，Hcy能夠引起小鼠小腦顆粒神經元ERK磷酸化，且在Hcy處理20 min時，ERK1/2磷酸化最明顯。

2.2 EGFR特異性拮抗劑AG1478可阻斷Hcy誘導的ERK1/2磷酸化反應（圖2）

Western blot結果顯示，與生理鹽水對照組和AG1478對照組相比，Hcy處理組小鼠小腦顆粒神經元中磷酸化的ERK1/2明顯增加（P<0.05），而經過AG1478預處理15 min后再加入Hcy的AG1478+Hcy處理組則未見統計學差異。

2.3 AG1478可促進Hcy誘導的小鼠小腦顆粒神經元凋亡

在培養7 d的小鼠小腦顆粒神經元中加入Hcy 6 h后，通過流式細胞儀可以檢測到明顯的細胞凋亡；AG1478+Hcy處理組當加入AG1478行預處理15 min后再加入Hcy 6 h時所檢測到的細胞凋亡率明顯高于單純Hcy處理組（P<0.05）；生理鹽水對照組和AG1478對照組則未見明顯細胞凋亡（圖3）。

3 討論

研究表明α2A-腎上腺激動劑主要通過兩種途徑引起ERK磷酸化［6］：一種是直接導致ERK磷酸化；另一種是通過兩步間接激活：（1）Gi蛋白通過酪氨酸激酶激活β、γ亞基，導致金屬蛋白酶促進上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）膜外部份脫落；（2）釋放的EGF間接激活自身和相鄰的EGFR，形成Grb2-Sos1復合物，導致ERK磷酸化。不同類型細胞不同G蛋白耦聯受體均存在間接激活途徑，最具代表性的是EGFR的間接激活途徑。1997年首次證實G蛋白耦聯受體激動劑能夠誘導ERK的活性，而EGFR特異性拮抗劑AG1478能夠抑制其活性［7］。這是細胞對外界刺激調節自身功能的一種新穎的方式。

Hcy與EGFR間接激活的相關性目前尚不清楚。有研究證明，Hcy可以引起ERK1/2的磷酸化，且Hcy可作用于谷氨酸受體引起神經細胞興奮性毒性。本研究結果發現，EGFR特異性拮抗劑AG1478可以阻斷原代培養的小鼠小腦顆粒神經元內Hcy激活的ERK1/2信號傳導途徑，從而證明了Hcy通過激活EGFR最終導致ERK1/2磷酸化。

ERK1/2的間接激活對于膠質細胞及其周圍神經元的功能有重要作用。α2A-腎上腺激動劑激活星形膠質細胞β、γ亞基，導致金屬蛋白酶促進HB-EGF膜外部份脫落，進而間接激活自身及相鄰細胞如神經元上的EGFR，從而激活ERK磷酸化，這一過程被認為與細胞保護作用有關［8］。上皮生長因子廣泛存在于腦內的神經元及星形膠質細胞內，具有促進星形膠質細胞和干細胞的增生、神經形成［9］以及促進有絲分裂神經元的生存和分化的功能［10］。

一般認為，EGFR的間接激活具有神經保護作用，但關于Hcy引起的ERK1/2磷酸化是否具有神經保護作用，目前尚無定論。Robert等［11］在半胱氨酸β合成酶缺陷大鼠海馬切片同型半胱氨酸毒性試驗中未發現ERK1/2磷酸化能減少海馬神經元的凋亡，Pei等［12］則認為Hcy的谷氨酸興奮性毒性與凋亡無關。本研究通過流式細胞儀檢測發現，在培養7 d的小鼠小腦顆粒神經元中加入Hcy 6 h后，通過流式細胞儀可以檢測到明顯的細胞凋亡；而當加入AG1478行預處理15 min后再加入Hcy 6 h時所檢測到的細胞凋亡率明顯高于單純Hcy處理組（P<0.05），提示ERK1/2磷酸化可能具有潛在的神經保護作用。

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