血管緊張素Ⅱ受體抑制劑對雌激素誘導的Ishikawa細胞的增殖及凋亡的影響

蘇卿，楊清

（中國醫科大學 附屬盛京醫院第一微創婦科，沈陽 110004）

肥胖、高血壓、糖尿病是子宮內膜癌的高危因素，被稱為“宮體癌綜合征”。而肥胖、高血壓和糖尿病患者體內的血管緊張素Ⅱ水平及雌激素水平均較高，所以我們選擇saralasin（沙拉新，血管緊張素Ⅱ抑制劑）來阻斷，探討血管緊張素Ⅱ受體在子宮內膜癌中的作用。本研究應用四甲基亞唑藍（MTT）和流式細胞技術觀察saralasin對雌激素作用下的子宮內膜癌細胞的增殖、凋亡和細胞周期的影響。

1 材料

1.1 細胞系

人子宮內膜癌ishikawa細胞系來源日本大學婦產科實驗室饋贈，經檢測雌激素受體和孕激素受體表達均陽性。

1.2 試劑

水溶性17β-雌激素、saralasin、四甲基亞唑藍（MTT）和碘化丙啶（PI）購自美國sigma公司，兔抗人AT1-R購于博奧森生物公司，AT1-R山羊抗兔TITC標記熒光抗體購于北京中杉生物公司，AnnexinⅤ-TITC試劑盒購于晶美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：ishikawa細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中，于37℃、體積分數5%ml/L的CO2孵育箱中培養貼壁生長，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 免疫熒光技術：檢測AT1-R在ishikawa細胞的表達，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 細胞增殖率的測定：應用MTT的方法，設立調零孔及等量含有相同濃度的DMSO的DMEM培養液作為陰性對照，試驗孔中加入雌激素濃度分別為 10-6、10-8、10-10、10-12mol/l，每列設 5 復孔。于加藥后30 min后終止反應，測吸光度（A）值。同理，確定雌激素濃度后我選擇 5、10、15、30、60 和 120 min 測其作用時間；測saralasin的作用濃度和各實驗組不同時間的增殖率，實驗重復3次，增殖率或抑制率=（實驗組-對照組）/（對照組-空白組）。

1.2.4 細胞周期的測定：實驗分分3組，第1瓶加入含10%胎牛血清的DMEM培養液4ml。第2瓶加入雌激素濃度為10-8mol/l的DMEM培養液4 ml，第3瓶加入含雌激素濃度為10-8mol/l和saralasin濃度為10-6mol/l的DMEM培養液4 ml，分別于加藥后10 min終止反應，取1×106個細胞打入預冷的5 ml 70%的乙醇中，封口膜封口，4℃固定過夜，加入RNase-A 3 ul至濃度為 50 ug/ml，37℃水浴消化 30 min，加PI76 ul至濃度約為100 ug/ml，在冰浴中避光染色30 min。流式細胞儀上計數細胞，采用細胞周期分析軟件處理。

1.2.5 細胞凋亡的檢測：采用AnnexinⅤ/PI雙染色法，各組加入處理因素，作用10 min后，按照試劑盒操作步驟收集細胞、處理樣本，立即上機檢測。

1.2.6 統計學處理：采用SPSS13.0統計軟件進行分析，實驗數據以x±s表示，分析采用方差分析，組間比較用LSD法，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光結果

用AT1-R抗體做免疫熒光實驗在熒光顯微鏡下觀察，結果如下可見實驗組細胞膜和細胞質染成綠色，呈陽性表達，核染成藍色。陰性對照組細胞不著色。（圖1）

2.2 MTT實驗結果

2.2.1 雌激素對ishikawa細胞增殖影響：各種濃度的雌激素 （10-12mol/L，10-10mol/L，10-8mol/L，10-6mol/L，10-4mol/L）促增殖作用比較，以10-8mol/L作用最強，所以以后試驗組以雌激素濃度為10-8mol/L作為誘導濃度；測 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min和120 min雌激素對ishikawa細胞的促增殖作用，以30 min作用最強。雌激素對ishikawa細胞具有促進細胞增殖的作用，具有劑量依賴性和時間依賴性。

2.2.2 saralasin對ishikawa細胞增殖的影響：saralasin對ishikawa細胞的抑制作用具有濃度依賴性。隨著 saralasin 濃度 10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L的增加其對ishikawa細胞的抑制率36.30%、25.34%、19.29%也增加。

2.2.3 saralasin對不同時間雌激素誘導的ishikawa細胞增殖的影響（表1）：以上數據中根據先期試驗先確定了雌激素的誘導濃度10-8mol/L和saralasin的濃度10-6mol/L，然后發現saralasin在5 min時已經開始起抑制作用，在雌激素誘導下，不同時間各組間只有10min組與對照組比有統計學意義（P<0.05）。因此我們后續實驗采用10 min，來研究細胞周期和凋亡。

表1 saralasin對雌激素誘導不同時間下ishikawa細胞增殖的作用Tab.1 The effect of saralsin on the proliferation of ishikawa induced by estrogen

2.3 細胞周期實驗結果

流式細胞儀檢測細胞周期結果見圖2：雌激素組G0/G1期減少，S期增多；saralasin組G0/G1期增多，S期減少，這提示saralasin使雌激素誘導10 min的ishikawa細胞發生了G0/G1阻滯，抑制了細胞生長。各組間差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 細胞凋亡實驗結果

各組細胞經AnnexinⅤ/PI染色，流式細胞儀檢測結果如圖3所示，saralasin能在10 min使雌激素誘導的ishikawa細胞發生凋亡，正常對照組細胞早期凋亡率為9.54%，雌激素組細胞早期凋亡率6.87%，saralasin組細胞早期凋亡率為13.19%，各組間差異有統計學意義（P<0.01）；晚期凋亡率和壞死率正常對照組為4.13%，雌激素組為4.79%，saralasin組為8.54%，各組間差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

3.1 雌激素對子宮內膜癌ishikawa細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的作用

目前研究認為雌激素有轉錄和非轉錄兩種效應，都是通過與其受體結合實現的，也有學者［1］認為雌激素與其受體結合后上述兩種效應協同發揮作用，促進細胞增殖。本實驗研究結果顯示，雌激素能夠促進ishikawa細胞增殖，且具有時間和濃度依賴性，在2 h內其刺激增殖作用以30min最強；使ishikawa細胞G1期下降，S期升高。雌激素能使子宮內膜癌ishikawa細胞周期中G1期比例下降，S期比例增高，可見雌激素能誘導細胞的DNA合成增多，加快細胞G1期到S期的過渡，導致細胞的過度增殖。在30 min促進增殖作用最強，說明其刺激增殖作用主要是通過非轉錄效應實現的。在雌激素作用10 min后凋亡結果顯示，雌激素能使細胞的凋亡受到抑制，說明可能存在快速抑制凋亡的途徑。

3.2 Saralasin對子宮內膜癌ishikawa細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的作用

Saralasin是競爭性肽類AngⅡ受體抑制劑，具有在各種組織中與AngⅡ結合部位的高親和性，不影響AngⅠ向AngⅡ轉化，與其他激素受體無親和力，可以用saralasin阻滯，說明與AngⅡ受體在細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡中的作用。

研究表明有些腫瘤攜帶AT1-R，且AngⅡ及AT1-R可促進血管生成和癌細胞生長［2，3］。另外，大多數實體瘤患者，當被診斷為腫瘤時，其體內的基因已有多種改變，足以對抗單一的分子靶向治療。蛋白激酶C可以作為第二信使，可激活MAPK或PI3K/AKt信號轉導途徑，在腫瘤的發生、發展中起重要作用，因此我們選擇性的減少蛋白激酶C的產生，對預防腫瘤的發生、發展及改善甚至其轉歸都可能有重要作用。AngⅡ可以作用于AT1受體激活蛋白激酶C，因此試用saralasin阻斷其作用途徑，來探討其抑制MAPK或PI3K/Akt信號轉導途徑，進而抑制腫瘤細胞增殖的作用機制。本實驗MTT結果顯示，saralasin對細胞增殖有比較明顯的抑制作用，且具有濃度-時間依賴性；從相對抑制率看，在10 min時有相對明顯的抑制作用，說明saralasin起作用早，可能存在與雌激素類似的快速的非轉錄作用抑制途徑，15 min作用減弱，30 min后抑制作用逐漸增強，這可能是隨著雌激素的刺激增殖能力增強，saralasin的作用相對減弱，在30 min后，雌激素的作用減弱，saralasin的作用更加明顯，說明此藥可能在短時間內一直存在著對腫瘤細胞的抑制作用。

流式細胞儀檢測細胞周期發現，saralasin阻滯ishikawa細胞于G0/G1期，細胞凋亡增加，可能通過AT1-R干擾多種細胞蛋白的功能；因此我們下一步將用siRNA方法沉默AT1-R檢測周期和凋亡情況及相關蛋白的變化。

3.3 saralasin的應用前景

本研究結果顯示，AT1受體競爭性抑制劑saralasin對人子宮內膜癌細胞系ishikawa的增殖有明顯的抑制作用，可使細胞周期停滯G1期，并可誘導ishikawa 細胞凋亡。這與 Arrieta［4］、Yamagishi［5］等首次用AT1-R拮抗劑坎地沙坦（candesartan），4 mg/d治療激素抵抗的前列腺癌患者，取得較好的療效的結果比較接近。AT1受體抑制劑對子宮內膜癌細胞有抑制增殖、誘導凋亡的作用。這可能為研究子宮內膜的發病機制提供新線索，同時為子宮內膜癌的化療提供新方向，減少化療反應。

［1］Levin ER.Cellular functions of plasmamembrane estrogen recep tors［J］.Steroids，2002，67（6）：471-475.

［2］Egami K，Murohara T，Shimada T，et al.Role of host angiotensin Ⅱtype1receptorintumorangiogenesisandgrowth［J］.JClinInvest，2003，112（1）：67-75.

［3］吳若飛，劉景晶.血管緊張素Ⅱ受體與腫瘤關系的研究進展［J］.現代醫學，2005，33（6）：414-416.

［4］Arreta O，Guevara P，Escobar E，et al.Blockageof angiotensin IItype Ireceptor decreasesthesynthesisof growth factorsand inducesapoptosisin C6 cultured cellsand C6 rat glioma［J］.Br JCancer，2005，92（7）：1247-1252.

［5］Yamagishit，Uemura H，Nakaigawa N，et al．Angiotensin Ⅱ blocker de-creases serum prostate specific antigen in hormone refractory prostatecancer［J］.JUrol，2005，173（2）：441-441.