激活過氧化物酶體增殖物激活受體-δ對(duì)梗死心肌腱糖蛋白表達(dá)的影響

楊大春，馬雙陶，速曉華，李秀川，張繼紅，唐兵，李德，楊永健

（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，成都 610083）

腱糖蛋白（tenascin-C，TN-C）屬于心肌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的成員之一，最近研究證實(shí)TN-C能促進(jìn)梗死后心肌重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生［1］。本研究建立心肌梗死模型，用過氧化物酶體增殖物激活受體-δ（peroxisome proliferator-activated receptorδ，PPARδ）激動(dòng)劑 GW610742X干預(yù)3個(gè)月，觀察左室梗死區(qū)左室游離壁（left ventricular free wall，LVFW）TN-C蛋白表達(dá)的變化，探討PPARδ在心肌重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：健康雄性3月齡Wistar大鼠購自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。GW610742X（GSK公司，美國），MMP-9抗體（Santa Cruz公司，美國），F(xiàn)N 抗體（Sigma公司，美國），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）。多導(dǎo)生理記錄儀（PowerLab/8SP，ADInstruments公司，澳大利亞）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：60只3月齡雄性健康Wistar大鼠，體質(zhì)量 220～250克，隨機(jī)分為以下幾組：（1）對(duì)照組，（2）假手術(shù)組，（3）心肌梗死（myocardial in－farction，MI）組，（4）心肌梗死+GW610742X（GW）組。每組動(dòng)物各15只。術(shù)前對(duì)照組及假手術(shù)組予以普通飼料喂養(yǎng)，GW組飼料中加入PPARδ激動(dòng)劑GW610742X（100 mg/kg/d）。喂養(yǎng)1周后建模。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)及取材：按照本室的方法建立大鼠心肌梗死模型［2］，術(shù)后各組大鼠分別予以普通飼料或GW610742X（100 mg/kg/.d）飼料喂養(yǎng)3個(gè)月后，禁食 12 h，10%烏拉坦（1 g/kg，腹腔注射）麻醉，頸動(dòng)脈插管測(cè)頸動(dòng)脈血壓及血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)。處死大鼠，去除心房后心臟稱重，計(jì)算心室指數(shù)，即心室/體質(zhì)量比值=HW（mg）/BW（g）。

1.2.3 心肌組織HE染色病理檢查：所有病理標(biāo)本應(yīng)用常規(guī)方法固定，染色。使用Motic image advance 3.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)TN-C的表達(dá)：收集LVFW心肌組織，提取組織總蛋白，定量，取50μg進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉后分別與一抗和二抗孵育。ECL法顯帶，X線片曝光。運(yùn)用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 免疫熒光法檢測(cè)TN-C的分布：按本室的方法進(jìn)行免疫熒光染色［2］，熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

3月后，對(duì)照組及假手術(shù)組心室指數(shù)、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）、±dP/dt（等容收縮期壓力上升最大速率和等容舒張期壓力下降最大速率）、左室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）與 MI組比較，有顯著差異（P ＜0.05）。GW組心室指數(shù)小于MI組，差異顯著（P＜0.05）；與MI組比較，GW組±dP/dt有升高趨勢(shì)，LVEDP有降低趨勢(shì)，但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂、血糖、心室指數(shù)及血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)比較Tab.1 Plasma lipids，glucose，ventricular index and hemodynamic parameters of rats

2.2 各組心肌組織病理變化

HE染色顯示，對(duì)照組及假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，橫紋清楚。MI組及GW組心肌纖維走向紊亂，橫斷面肌絲大小不一，部分心肌細(xì)胞肥大、胞漿空泡變性，核周尤為明顯，肌絲呈顆粒或絲網(wǎng)狀、間質(zhì)增寬。GW組除心肌細(xì)胞肥大外不同程度的心肌組織肌絲斷裂、壞死。MI組心肌組織肌絲斷裂、溶解、壞死。間質(zhì)膠原結(jié)締組織增生，心肌橫斷面肌絲大小不一、部分心肌細(xì)胞肥大、胞漿空泡變性，其在核周圍尤為明顯。見圖1。

2．3 各組心肌組織TN-C蛋白表達(dá)

假手術(shù)組與對(duì)照組TN-C蛋白表達(dá)顯著低于MI及GW組（P＜0.01），GW組TN-C蛋白表達(dá)低于MI（P＜0.01）。假手術(shù)組與對(duì)照組TN-C蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。

2．4 各組心肌組織TN-C的分布

免疫熒光顯示對(duì)照組和假手術(shù)組LVFW心肌組織基本無TN-C蛋白分布。GW組TN-C的分布低于心肌梗死組（MI）。

3 討論

PPARδ是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬Ⅱ型核受體超家族成員之一。PPARδ可與視黃酸X受體（RXR）結(jié)合形成異二聚體，與PPARs反應(yīng)元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）結(jié)合后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)［3］。

ECM是維系整個(gè)心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要由各型膠原、FN、LN等組成［4］。ECM組分的動(dòng)態(tài)變化在心肌重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，稱為ECM重塑。ECM成分的變化主要取決于其合成和降解之間的平衡。TN-C也屬于ECM的一個(gè)成員，在正常成年心肌中并不表達(dá)。但是，TN-C會(huì)重新出現(xiàn)在多種心肌損傷修復(fù)病理狀態(tài)下，如急性心肌梗死及梗死后心肌重構(gòu)［5，6］。本研究發(fā)現(xiàn)，心臟梗死區(qū)LVFW的TN-C蛋白表達(dá)升高。激活PPARδ后，梗死心肌組織TN-C的表達(dá)下調(diào)，據(jù)此，我們推測(cè)激活PPARδ后，能抑制TN-C的表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)TNC的出現(xiàn)不僅反應(yīng)了心肌損害的廣泛性，還預(yù)示著心肌重構(gòu)的嚴(yán)重性［7，8］。最近Nishioka等采用TN-C基因敲除小鼠證實(shí)了TN-C能促進(jìn)梗死后心肌重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生［1］。這說明抑制或下調(diào)TN-C可能成為抗心肌重塑的新型治療策略。在本研究中，激活PPARδ后，梗死心肌TN-C表達(dá)及分布減少。而GW組心功能指數(shù)較心肌梗死組有改善的趨勢(shì)，但未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能為樣本量較少或觀察時(shí)間較短所致。總之，通過激活PPARδ調(diào)控TN-C的表達(dá)，可能成為干預(yù)心肌重塑的靶點(diǎn)之一。而激活PPARδ后，是通過直接調(diào)控TN-C基因的表達(dá)，還是通過其他途徑間接調(diào)控TN-C的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。

［1］Nishioka T，Onishi K，Shimojo N，et al.Tenascin-Cmay aggravateleft ventricular remodeling and function after myocardial infarction in mice［J］.AmJPhysiol HeartCirc Physiol，2010，298（3）：H1072-1078.

［2］Yang D，Ma S，Li D，et al.Angiotensin IIreceptor blockadeimproves matrix metalloproteinases/tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 balance and restores fibronectin expression in rat infarcted myocardium［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，388（3）：606-611.

［3］Chinetti G，F(xiàn)ruchart JC，Staels B.Peroxisome proliferator-activated receptors（PPARs）：nuclear receptorsat thecrossroadsbetween lipid metabolism and inflammation［J］.Inflamm Res，2000，49（10）：497-505.

［4］Brown L.Cardiacextracellularmatrix：adynamicentity［J］.AmJPhysiol Heart Circ Physiol，2005，289（3）：H973-974.

［5］Donato G，Conforti F，Zuccala V，et al.Expression of tenascin-c and CD44 receptors in cardiac myxomas［J］.Cardiovasc Pathol，2009，18（3）：173-177.

［6］Tamaoki M，Imanaka-Yoshida K，Yokoyama K，et al.Tenascin-Cregulatesrecruitment of myofibroblastsduringtissuerepair after myocardial injury［J］.Am JPathol，2005，167（1）：71-80.

［7］Franz M，Berndt A，Altendorf-Hofmann A，et al.Serumlevelsof large tenascin-Cvariants，matrix metalloproteinase-9，and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in concentric versus eccentric left ventricular hypertrophy［J］.Eur JHeart Fail，2009，11（11）：1057-1062.

［8］Fujimoto N，Onishi K，Sato A，et al.Incremental prognostic values of serumtenascin-Clevels with blood B-type natriuretic peptide testing at discharge in patients with dilated cardiomyopathy and decompensated heart failure［J］.JCard Fail，2009，15（10）：898-905.