辛伐他汀對肺纖維化大鼠肺內結締組織生長因子表達的影響

馮彥華，肖莉，萬宏光，杜妍，何穎

（中國醫科大學 附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004）

肺纖維化（pulmonary fibrosis）是以成纖維細胞異常增殖、細胞外基質異常沉積為特征的慢性、進行性肺間質疾病，被診斷后中位生存期只有2～5年，傳統的糖皮質激素和免疫抑制劑治療效果并不明確［1］。肺纖維化的發病機理至今尚未明確，但已有研究顯示，多種細胞因子如轉化生長因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、白細胞介素13、血小板源性生長因子、干擾素γ等在肺纖維化的發病過程中起著非常重要的作用［2］，其中，CTGF作為一種重要的促纖維化性細胞因子，早已引起學術界的廣泛重視。有研究表明，過度表達的CTGF可以導致動物出現輕度、一過性肺纖維化［3］。除此之外，Watts等［4］的研究證實，在CTGF促進成纖維細胞分化過程中需要信號分子RhoA的參與，而后者的轉錄后修飾需要膽固醇合成代謝的中間產物焦磷酸糖牛兒酯的存在，因此，膽固醇的合成受抑就有可能影響CTGF對成纖維細胞分化的調節，進而對肺纖維化進程產生抑制作用。

他汀類藥物是3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，HMG-CoA）的抑制劑，具有明顯的抑制膽固醇合成代謝的作用。近年來，陸續有學者對他汀類藥物的抗纖維化作用進行了一些相關研究，發現辛伐他汀對肺成纖維細胞的預處理，不僅抑制了肺成纖維細胞RhoA活化、CTGF表達［5］，而且在一定程度上誘導成纖維細胞凋亡［6］。在這些細胞學研究的基礎上，本研究建立了博來霉素氣管內注射誘導的大鼠肺纖維化模型，并對大鼠進行辛伐他汀灌胃治療，通過病理組織學、生化學等方法觀察辛伐他汀對大鼠肺纖維化的治療作用，并通過免疫組化和光密度分析觀察辛伐他汀對纖維化大鼠肺組織CTGF表達所產生的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～210 g）由中國醫科大學實驗動物中心提供，博來霉素（Bleomycin，BLM）系日本化藥株式會社產品，辛伐他汀（舒降之）為杭州默沙東公司出品。Massion染色試劑盒購于廣州儷科公司，羥脯氨酸含量測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所，CTGF抗體、生物素標記二抗、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均為博士德生物工程有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和實驗設計：SD大鼠60只，隨機分為 4組：鹽水對照組（control group）、模型組（model group）、辛伐他汀即刻治療組（immediately simvastatin group）和辛伐他汀7 d后治療組（delayed simvastatin group）。實驗設計如下：模型組、辛伐他汀即刻治療組和辛伐他汀7 d后治療組均于水合氯醛（10%，0.3 g/kg）腹腔麻醉后氣管內一次性注射博來霉素5 mg/kg復制肺纖維化模型，鹽水對照組氣管內注入等容積的生理鹽水。建模后當日，辛伐他汀即刻治療組每日胃管內注入辛伐他汀生理鹽水混懸液20 mg/kg；鹽水對照組、模型組每日胃管內注入等容積的生理鹽水；辛伐他汀7 d后治療組于建模7 d內每日胃管內注入等容積的生理鹽水，7 d后改為每日胃管內注入辛伐他汀生理鹽水混懸液20 mg/kg。各組動物均于建模7 d、14 d和28 d后各處死5只，觀察肺組織病理學改變、羥脯氨酸含量變化以及肺組織CTGF的表達。

1.2.2 肺組織病理學觀察：取右肺下葉，4%中性福爾馬林固定后，按常規病理學方法脫水、包埋、切片、HE染色、Masson染色。

1.2.3 肺組織羥脯氨酸含量測定：按羥脯氨酸含量測定試劑盒的操作步驟，稱量左肺組織30~50 mg，加入水解液1 ml進行樣本水解，之后加入pH甲液、乙液調節pH值至6.0～6.8，活性炭吸附后離心，提取上清液1ml后測定各樣本吸光度。

1.2.4 肺組織CTGF的表達：按博士德公司SABC免疫組化染色試劑盒使用說明書進行操作，用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復，DAB顯色液顯色，陰性對照以PBS代替一抗。CTGF陽性細胞表現為細胞漿內有棕褐色顆粒沉積，陰性對照則無。每張切片隨機選取10個無重疊400倍高倍視野，應用NIS-Elements F2.30圖像采集軟件進行圖像采集，NIS-Elements BR3.0圖像分析軟件計算平均光密度（mean optical density，MOD），以 MOD 作為 CTGF表達的半定量參數。

1.3 統計學分析

所有數據均為計量資料，以x±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，有顯著性差異者進一步用Student-Newman-Keuls檢驗進行兩兩比較。P<0.05作為具有統計學差異標準，P<0.01為具有統計學極顯著差異標準。統計分析采用SPSS 10.0統計軟件完成。

2 結果

2.1 辛伐他汀對肺纖維化大鼠肺組織病理學改變的影響

2.1.1 肺組織HE染色：鹽水對照組大鼠肺泡結構清晰，肺泡腔大小均勻、無明顯炎性細胞浸潤，肺泡間隔無增厚，無明顯纖維組織增生。模型組大鼠7 d時肺泡腔內可見大量中性粒細胞浸潤，肺泡間隔膠原纖維增生少見；14 d時肺泡腔內炎性細胞明顯減少，間隔內膠原纖維明顯增生；28 d時大量肺泡結構破壞、萎陷，膠原纖維廣泛增生，偶見肺泡腔代償性擴張。與模型組相比，辛伐他汀即刻治療組和辛伐他汀7 d后治療組7 d時病理表現差異不明顯；14 d時中性粒細胞浸潤較少，部分肺泡間隔纖維組織輕度增生；28 d時部分肺泡間隔內膠原纖維增生，周圍可見較多量正常肺泡（圖1）。

2.1.2 肺組織Masson染色：鹽水對照組肺泡周圍可見少量藍染的膠原纖維。模型組大鼠14 d時膠原纖維明顯增生，28 d時可見藍染的膠原纖維廣泛大量增生，肺泡結構破壞。辛伐他汀即刻治療組和辛伐他汀7 d后治療組膠原纖維輕-中度增生，較模型組增生程度明顯減輕（見圖2）。

2.2 辛伐他汀治療對肺纖維化大鼠肺組織羥脯氨酸含量的影響

氣管內滴注博來霉素后，模型組大鼠肺組織羥脯氨酸含量逐漸增高，與對照組相比有統計學意義；在28 d時，辛伐他汀即刻治療組、辛伐他汀7 d后治療組肺組織羥脯氨酸含量，均明顯低于模型組并有統計學意義，提示無論是辛伐他汀的即刻治療還是7 d后的延遲治療，均可對纖維化大鼠的肺組織膠原纖維形成產生有效的抑制作用（表1）。

2.3 辛伐他汀對肺纖維化大鼠肺組織CTGF表達的影響

CTGF的免疫組化和光密度分析結果顯示：氣管內滴注博來霉素后，模型組大鼠肺組織CTGF的表達在7 d時達峰，并在之后的28 d內維持在較高水平；在14 d、28 d時，辛伐他汀即刻治療組、辛伐他汀7 d后治療組肺組織CTGF表達，均明顯低于模型組并有統計學意義，提示無論是辛伐他汀的即刻治療還是7 d后的延遲治療，均可對纖維化大鼠的肺組織CTGF表達產生有效的抑制作用（表1，圖3）。

表1 氣管內滴注BLM后各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量和CTGF平均光密度的變化（x±s）Tab.1 Changes of the hydroxyproline content and the MOD of CTGF in rat lungs after intratracheal BLM instillation（x±s）

3 討論

博來霉素氣管內滴注復制的肺纖維化模型被認為是研究肺纖維化的經典模型，應用最為廣泛［7］。氣管內滴注博來霉素后，肺組織早期以肺泡炎為主，肺泡腔和肺泡間隔出現大量炎性細胞浸潤，大約在9 d左右［8］，肺泡炎開始向纖維化轉變，并在3~4周后形成彌漫纖維化：肺泡結構廣泛破壞、肺泡腔萎陷、甚至消失，肺泡間隔增寬，肺間質內出現大量膠原纖維和成纖維細胞。本研究模型組大鼠的肺組織病理改變和羥脯氨酸含量測定結果與上述變化基本一致，標志建模成功。

CTGF是一種富含半胱氨酸的多肽，分子量為38 kDa，于1991年在人臍靜脈內皮細胞的條件培養液中被發現［9］。CTGF可被TGF-β、凝血酶等多種促纖維化介質所誘導，對于成纖維細胞向肌成纖維細胞分化和細胞外基質的分泌起著非常重要的作用［10，11］。Lasky等［12］發現，在博來霉素誘導的纖維化肺組織中，CTGF的表達明顯增高。與此相一致的是，Allen等［13］在特發性肺纖維化患者的肺組織和支氣管肺泡灌洗液的細胞內也發現表達異常增高的CTGF。本研究結果與此相似，氣管內滴注博來霉素后，大鼠肺組織CTGF表達明顯增高，在1周左右達峰，之后持續高表達水平。

辛伐他汀是一種常用的他汀類降脂藥，作用肯定，療效安全。已有研究證實，辛伐他汀對肺成纖維細胞的預處理，不僅抑制了CTGF的基礎活性，也抑制了TGF-β對CTGF活性的誘導，該作用依賴于辛伐他汀對信號分子RhoA轉錄后修飾的抑制。Burke等［14］人的研究發現，TGF-β1介導了成纖維細胞 Smad2/3的磷酸化、CTGF和膠原蛋白Iα-2的合成以及1型纖溶酶原激活物抑制物的激活，并最終誘導了成纖維細胞活化，而辛伐他汀對成纖維細胞的預處理，對TGF-β1所介導的上述多種致纖維化作用均產生有效抑制。本研究結果表明，氣管內滴注博來霉素后對大鼠進行辛伐他汀治療，抑制了纖維化肺組織CTGF的高表達，降低了肺組織羥脯氨酸含量，并改善了肺組織的纖維化病理改變。

除此之外，本研究尚證實了辛伐他汀的延遲治療作用。Moeller等［15］認為，在博來霉素建模7 d內進行藥物治療，只能被稱為“預防性療法”；只有在博來霉素建模7 d后進行藥物治療，才能被稱為“治療性療法”。這是因為前者的“抗纖維化”療效，有可能源于其對起始階段炎癥和早期纖維化反應的干擾，而在肺纖維化反應已經始動并進行性加重階段，該種藥物能否緩解纖維化損害，仍存在疑問。因此，“治療性療法”更具有研究價值。本研究提示，在博來霉素氣管內滴注7 d后給藥，辛伐他汀仍能有效抑制纖維化肺組織CTGF的高表達，降低肺組織羥脯氨酸含量，改善肺組織的纖維化病理改變，進一步肯定了辛伐他汀對肺纖維化的抑制作用。

總之，本研究結果顯示，在博來霉素誘導的大鼠肺纖維化過程中，辛伐他汀有效抑制了肺組織CTGF高表達，改善肺組織纖維化程度，證實了辛伐他汀的延遲治療作用，為辛伐他汀治療肺纖維化提供新的理論依據。

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