黃芪對慢性阻塞性肺病大鼠氣道炎癥干預作用實驗研究

楊 月,侯繼申,池紅井,范常艷,韓 梅

(承德醫學院附屬醫院,河北承德 067000)

黃芪類化合物有多種生物學活性,具有調節免疫、抗病毒等多方面的藥理作用[1]。黃芪的有效成分黃芪總酮(TFA)和黃芪總皂甙(AST)具有清除氧自由基的能力,可防止生物膜的脂質過氧化,TFA的抗氧化作用可能是其抗炎作用的機制之一[2]。2008年3月 ～2009年 1月,本實驗選擇熏香煙加氣管內注入脂多糖(LPS)法[3]致慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型,探討黃芪對 COPD大鼠氣道炎癥是否具有抑制作用,為臨床應用黃芪治療 COPD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康 SD大鼠 30只,體質量(210±20)g,雌雄不限,由遼寧醫學院實驗動物中心提供。隨機分成 3組,每組 10只。①正常對照組:在正常環境下飼養,第 8天起每天腹腔注射0.9%生理鹽水 0.05 ml/kg,第 28天處死。②COPD模型組:將大鼠于第 1、14天氣管內注入 LPS各 200 μg/200μl,第 2～13天、第 15～28天每天在 70 cm×50 cm×50 cm的密閉箱內吸煙,吸煙量為 14支/次,2次/d,其中每次吸煙時間 1 h,兩次吸煙間隔為1 h。第 8天起每天腹腔注射 0.9%生理鹽水 0.05 ml/kg,至第 28天處死。③黃芪干預組:氣管內注入LPS及熏香煙過程同 COPD組,第 8天起每天腹腔注射黃芪注射液 250 mg/kg,至第 28天處死。

1.2 大鼠血清采集 將大鼠用 2%戊巴比妥(25 mg/kg)麻醉后,用毛細玻璃管(內徑 1.0 mm)在大鼠眶下靜脈叢取靜脈血 1 ml,室溫下靜置約 1 h,充分凝固后置 4℃過夜,以 1 500 r/min離心 30 min,吸取上部清亮的血清保存于 -20℃冰箱中待檢。

1.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)采集 切開胸部,暴露氣管及肺部,結扎右主支氣管,在隆突上用套管針穿刺至左肺,以 2 ml生理鹽水灌洗左肺,每次回收約 1.5 ml(回收率 75%),反復灌洗 3次,總回收量約 4.5 ml。將收集到的 BALF經紗布過濾,離心,取上清液置入 EP管保存于 -20℃冰箱中待檢,收集下部 2 ml左右,混勻作細胞計數。

1.4 氣管和肺組織采集 松開結扎的右主支氣管,將毛細玻璃管固定于右主支氣管內,向右肺內注入10%中性甲醛溶液,使肺復張,取中葉肺組織 1 mm3大小,置于 4%戊二醛中；取隆突上 2～3 mm處的氣管及中葉肺組織 5 mm3大小,置于 10%中性甲醛溶液中。將經過 10%中性甲醛溶液固定的肺組織和氣管,在垂直于支氣管、細支氣管斷面的右肺中葉矢狀面最大周徑處進行橫貫取材,酒精梯度脫水；二甲苯透明標本 2～3次,每次 5 min；浸蠟(時間 ＞3 h),包埋,切片(厚 5μm),HE染色。將經過 4%戊二醛固定的 1 mm3右肺組織漂洗,用 2%四氧化鋨后固定 2 h,再漂洗,丙酮梯度脫水,包埋,聚合；超薄切片(厚 0.1μm),醋酸鈾—枸櫞酸鉛電子染色。

1.5 炎癥指標檢測 采用放射免疫法測定各組大鼠血清和 BALF中 IL-8和 TNF-α的含量,操作按試劑盒說明步驟進行。

1.6 統計學方法 采用 SPSS 12.0軟件進行統計學分析,計量資料以±s表示,兩組間數據比較用t檢驗,3組間數據比較用單因素方差分析,以 P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 正常對照組大鼠毛發順滑,有光澤,神情活潑；COPD組大鼠毛發失去光澤,黃澀,神情倦怠；黃芪干預組大鼠毛發順滑,有光澤,但神情較正常對照組略呆板。第 28天正常對照組體質量(241.6±21.5)g、COPD組 (225.3±19.1)g、黃芪干預組(230±17.3)g,3組之間比較差異無統計學意義。

2.2 病理形態觀察

2.2.1 肺大體形態觀察 正常對照組大鼠肺表面光滑平整,呈淡粉紅色,質地均勻,彈性適當；COPD組大鼠肺呈膨脹狀態,體積較正常對照組明顯增大,顏色蒼白,彈性減弱；黃芪干預組較 COPD組有改善但不如正常對照組。3組大鼠肺組織表面均無出血,無液體滲出。

2.2.2 光鏡觀察 正常對照組鏡下可見大鼠正常氣管及各級支氣管上皮,纖毛豐富、排列整齊,在纖毛細胞間夾雜有少數杯狀細胞,肺泡結構完整,肺泡間隔無破壞；COPD組大鼠氣管及各級支氣管可見不同程度的炎癥細胞(淋巴細胞、中性粒細胞)浸潤,黏膜上皮可見纖毛倒伏、粘連或脫落,纖毛細胞可見變性、壞死或脫落,杯狀細胞明顯增多,胞體增大。周邊肺組織普遍存在小葉中央型肺氣腫,表現為肺泡結構紊亂,肺泡壁變薄斷裂,肺泡腔擴大,部分融合為肺大皰；黃芪干預組大鼠肺組織炎癥細胞浸潤減少,支氣管黏膜上皮纖毛脫落及肺泡壁變薄、斷裂等損傷現象有所改善。

2.2.3 電鏡觀察 正常對照組氣管、支氣管黏膜上皮細胞纖毛排列整齊,無脫落,肺泡上皮細胞器結構正常,肺氣血屏障結構完整,毛細血管內皮細胞無腫脹及空泡變性；COPD組Ⅰ型肺泡上皮細胞腫脹和脫落,杯狀細胞分泌增加,Ⅱ型肺泡上皮細胞增生,板層小體排空,線粒體腫脹,空泡變性,內質網擴張,核固縮,表面纖毛減少脫落,肺泡腔內的巨噬細胞溶酶體增多；黃芪干預組Ⅰ型肺泡上皮細胞腫脹和脫落,Ⅱ型肺泡上皮細胞線粒體腫脹、板層小體排空等損傷有所改善。

2.3 BALF細胞計數 見表1。

表1 3組大鼠 BALF細胞計數比較(±s)

表1 3組大鼠 BALF細胞計數比較(±s)

注:與正常對照組比較,*P＜0.01；與COPD組比較,△P＜0.05

組別 白細胞(×108/L)中性粒細胞(×108/L)中性粒細胞百分比(%)正常對照組 1.98±0.96 0.125±0.013 5.82±3.60 COPD組 5.76±0.29*1.160±0.132*19.81±4.12*黃芪干預組 2.52±0.13△ 0.196±0.124△ 7.28±3.35△

2.4 炎癥指標 見表2。

表2 3組大鼠血清和 BALF中 IL-8和 TNF-α的水平比較(pg/ml,±s)

表2 3組大鼠血清和 BALF中 IL-8和 TNF-α的水平比較(pg/ml,±s)

注:與正常對照組比較,*P＜0.05,△P＜0.01；與 COPD組比較,#P＜0.05

組別 IL-8血清 BALF TNF-α血清 BALF正常對照組 39.8±14.5 101.5±16.4 68.6±12.3 70.6±8.9 COPD組 79.6±5.9△ 243.4±21.1△ 98.3±21.1*135.8±16.7△黃芪干預組 47.6±3.8#115.1±17.6# 75.4±15.2#78.1±10.8#

3 討論

細胞因子 TNF-α、IL-8與 COPD的病理生理機制有密切的關系。本研究 COPD大鼠 IL-8、TNF-α的水平較正常對照組增高[4]。IL-8是選擇性 PMN趨化因子,在 COPD氣道炎癥中的作用主要是通過趨化、激活 PMN和嗜酸性粒細胞等炎癥細胞,使之合成、釋放 IL-8、TNF-α等細胞因子和炎癥介質,進一步加重 COPD氣道炎癥反應,加重肺組織與氣道結構的病理損害。TNF-α是具有多種免疫功能的調節因子,在 COPD氣道炎癥中可促進炎癥細胞黏附、游走和浸潤,迅速引起肺損傷[5]。在生理情況下,TNF-α可刺激花生四烯酸類炎性物質釋放,在并發感染情況下,這種刺激更明顯,其結果可誘發過度炎癥反應。在 IL-8基因的增強啟動區域內含有對TNF-α的功能反應成分,因此 TNF-α可以在轉錄水平刺激 IL-8的合成,TNF-α、IL-8共同參與 COPD氣道炎癥反應及氣道結構的重塑。本研究黃芪干預組大鼠 BALF和血清中 TNF-α、IL-8濃度較 COPD組下降。IL-8的下降可減少 PMN在肺內的聚集,從而減緩氣道炎癥的進展。AST可減少滲出液中 IL-8的含量,降低滲出液及 PMN中磷脂酶 A2活性,減少 PMN超氧陰離子生成及滲出液中一氧化氮的生成量。而黃芪多糖可增強血管內皮細胞與白細胞的黏附,并對 TNF-α、IL-1促進內皮細胞與白細胞黏附有協同增強作用,從而發揮抗炎作用[6]。此結果提示,通過對 TNF-α、IL-8的抑制,使炎癥細胞的聚集、趨化減輕可能是黃芪干預 COPD氣道炎癥反應的機制之一。

本研究顯示,經黃芪治療后,COPD大鼠 BALF中白細胞總數、PMN絕對計數和百分比降低。可見黃芪對 COPD氣道炎癥有一定的治療作用,可部分改善氣道腔中以 PMN為主的炎癥。抑制炎癥細胞的機制可能在于黃芪激發了腎上腺皮質功能,而皮質激素具有較強的抗炎作用,能影響白細胞的移動和分布,抑制某些生物活性物質的釋放,增強機體抗炎、抗缺氧的能力。其次,APS通過促進內皮細胞表面黏附分子的表達而促進 PMN與內皮細胞的黏附,從而抑制炎癥反應。氧化/抗氧化失衡參與了COPD的發病過程。實驗證實,AST可使角叉菜膠誘導大鼠氣囊的滲出液量、PMN游出數和蛋白滲出量明顯減少,其抗炎機制與抑制白細胞游出,減少IL-8、一氧化氮等炎癥介質的產生及抑制氧自由基生成有關[7]。黃酮類化合物抗炎作用是以其抗氧化活性為基礎的,與抗自由基或抗脂質過氧化有關。

總之,COPD的發病機制是非常復雜的,非特異性炎癥是其共同的病理表現。TNF-α、IL-8參與了COPD的發病過程,中藥黃芪可一定程度下調 COPD時 TNF-α、IL-8的表達,減少氣道炎癥細胞的浸潤,對 COPD大鼠氣道炎癥有抑制作用。

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