組織工程化人工骨種植體修復兔骨缺損效果研究

黃文良,鄧 江,苑 成,阮世強

(遵義醫學院第三附屬醫院,貴州遵義 563002)

如何解決骨缺損的修復問題一直是骨外科、整形外科醫師研究的重大難題之一[1]。近年來國內外對重組人胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)[2]、羥基磷灰石(CHA)[3]和自體紅骨髓(ABM)[4]進行了諸多研究,但只涉及一種或兩種成分或其中一種成分與其他生長因子合用對骨缺損修復作用的研究,且仍未達到理想效果。2008年 3月 ～2009年 6月,本研究通過將 CHA、IGF-Ⅰ與 ABM三者復合構建組織工程化人工骨種植體,并將其植入動物體內,從組織學角度探討修復骨缺損的效果,為今后更好應用于臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康中國家兔(遵義醫學院動物實驗中心提供)36只,2.5 kg,雌雄不限,隨機分為 A、B、C、D、E、F共 6組,各組種植體分別為CHA/IGF-Ⅰ /ABM、CHA/IGF-Ⅰ 、CHA/ABM、CHA、ABM、空白。

1.2 材料 IGF-Ⅰ(上海麥莎生物科技有限公司),CHA(上海睿星基因技術有限公司,每塊 5 mm×5 mm×20 mm大小,平均孔徑 200μm,孔隙率55%,抗壓 3.3 k Pa,γ射線消毒滅菌)。

1.3 方法

1.3.1 CHA/IGF-Ⅰ的制備 無菌條件下,參照Zambonin等[5]的附壁方法,IGF-Ⅰ以濃度 400 ng/ml與 CHA混合后 4℃充分吸附 48 h,測量每塊 CHA吸附 IGF-Ⅰ約 140 ng。

1.3.2 CHA/IGF-Ⅰ/ABM和 CHA/ABM的制備無菌條件下,用 16號骨穿針從兔股骨大轉子穿刺,用肝素預濕后空針抽吸骨髓約 2 ml,搖勻后分別接種于 CHA/IGF-Ⅰ和 CHA各 1 ml,充分吸附 0.5 h。

1.3.3 模型制作 以 3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)靜脈麻醉家兔,備皮、消毒鋪巾,切開皮膚逐層分離,充分暴露前臂橈骨中段,制作約 2 cm的橈骨全層缺損模型,生理鹽水沖洗傷口后分別移植相應材料。術后傷口紗布包扎,不用外固定,前 3天每只肌注慶大霉素 2萬 U/d,同術前喂養方法籠養。

1.3.4 檢測指標 分別于 4、8、12周觀察。大體觀察:觀察家兔術后精神狀態、進食、活動和傷口愈合情況；處死后對標本及其周圍組織的情況進行大體觀察。組織學觀察:①空氣栓塞處死動物后截取帶宿主骨端 0.3 mm移植物,剔除附著的軟組織,10%中性甲醛固定24 h,5%硝酸脫鈣、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。沿長軸制 5μm切片,HE染色,光鏡觀察；②組織學評估:評分內容包括連接(無連接 0分；纖維連接 1分；骨與類骨連接 2分；骨連接 3分；骨干完全再生 4分)、松質骨 (無骨細胞活性 0分；新骨早期聚集 1分；有活性的新骨聚集 2分；松質骨正在改造 3分；松質骨完全形成 4分)、皮質骨(無皮質骨形成 0分；皮質骨生長的早期表現 1分；皮質骨正在形成 2分；大部分被改造 3分；完全骨再生 4分)3個方面 12項。

1.3.5 統計學方法 采用 SPSS 13.0統計軟件進行處理,評分結果采用 F檢驗,以 P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 大體標本觀察 術中因麻醉意外死亡 1只,術后第 5、6天腹瀉死亡 2只,后補做 3只,術后前 3天所有家兔精神狀態稍差,飲食活動減少,術肢稍腫脹、跋行。第 4天恢復正常活動,飲食、精神狀態好。術后所有家兔手術切口干燥,局部無感染征象。在各個時期均未見植入物排出或脫出現象。A、C組:術后 4周植入部位周圍有較多軟組織包裹,骨端有部分骨痂連接,植入物無活動；術后 8周植入部位周圍有大量軟組織包裹,植入物表面有較多骨痂形成,與骨端連接緊密；術后 12周缺損部位骨皮質與骨端皮質連續,塑形較好,肉眼無法分辨缺損區。B、D組:術后 4周植入部位周圍有較少軟組織包裹,骨端未見骨痂連接,植入物易活動；術后 8周植入部位周圍有少量軟組織包裹,植入物表面有較少骨痂形成,與骨端連接疏松,有少量新骨形成；術后 12周植入物兩端有新骨包繞,與骨端連接緊密,骨塑形差。E組:術后 4周骨缺損區大部分以軟組織填充,靠近尺骨側有較少骨痂形成；術后 8周骨缺損區大部分以軟組織填充,靠近尺骨側有少量骨痂形成,骨端有少量骨痂連接；術后 12周骨缺損區仍有 2/3以軟組織填充,骨痂增多,骨端有明顯骨痂連接。F組:術后骨缺損區均以軟組織充填,大小基本未變,4周兩骨端開始萎縮、封閉；12周兩骨端已萎縮硬化、髓腔完全封閉,缺損區無骨性連接。

2.2 組織病理學觀察 A組:術后 4周植入物可見大量較成熟骨小梁出現,仍能見到少量類骨質和軟骨化骨現象；術后 8周可見成熟骨小梁大部分向板層骨轉化,骨痂改造、塑形明顯,已有皮質骨形成；術后 12周形成均勻致密的板層骨,較多貫穿連接,骨質更成熟。B、D組:術后 4周孔隙內多見纖維組織,軟骨和類骨質少見；術后 8周主要為島狀編織骨,板層骨少見；術后 12周有少量板層骨附壁,成熟度低。C組:術后 4周有島狀或帶狀的編織骨小梁形成；術后 8周編織骨向板層骨過渡,但板層骨形成較少；術后 12周形成均勻致密的板層骨,較少貫穿連接,成熟度低于 A組。E組:術后 4周可見較多類骨質及少量新生骨小梁,編織骨形成不明顯；術后 8周較多形成編織骨樣組織,個別標本仍能見到散在類骨質和軟骨組織；術后 12周形成板層骨樣組織,出現成熟骨小梁。F組:術后 4、8及 12周均為纖維瘢痕組織,僅在骨端有少量成骨。

2.3 評分結果比較 見表1。

表1 各組 Lane-Sandhu組織學評分結果比較(±s)

表1 各組 Lane-Sandhu組織學評分結果比較(±s)

注:與 A組比較,*P＜0.05

組別 術后 4周 術后8周 術后12周A組 6.60±0.57 8.85±0.49 10.00±0.14 B組 3.10±0.14* 4.65±0.21* 5.15±0.21*C組 4.95±0.49* 6.95±0.78* 8.35±0.21*D組 3.05±0.21* 4.60±0.57* 5.20±0.42*E組 4.40±0.57* 6.15±0.91* 6.95±0.21*F組 2.15±0.21* 3.10±0.14* 3.55±0.35*

3 討論

目前臨床上修復骨缺損的方法主要包括以下幾種:自體骨移植、同種異體骨和異種骨移植、人工骨移植。但存在著供體來源有限、排斥反應嚴重及并發癥多等許多問題。骨組織工程技術為解決骨缺損修復提供了新的思路,促進骨愈合有 3種作用機制[6]。CHA是由 Roy等于 1974年用天然海珊瑚在高溫、高壓條件下,經過“熱液交換反應”改進制成,具有較多的孔隙及均勻的孔隙率,與人體松質骨結構相似,為IGF-Ⅰ的附著、緩釋提供了良好的載體,并為骨傳導提供了良好的框架結構,為血管再生、骨沉積、骨再生提供了適宜的孔隙,其成骨潛能已被廣泛證實。而IGF-Ⅰ是一種具有多種生物學活性的骨生長調節因子。它們以內分泌、自分泌或旁分泌方式作用于骨骼細胞,一方面刺激成骨細胞和成骨前體細胞增殖、分化和基質合成,促進骨生長修復；另一方面,通過介導作用調節破骨細胞的分化形成和功能活性,在骨改建耦聯中發揮重要作用。另外,自體骨髓含有骨再生能力強的間充質干細胞,且抽吸創傷小,簡單易行,不引起免疫排斥反應,已成功地用于多種骨科臨床治療。

CHA、IGF-Ⅰ及 ABM的單一或兩者合用研究已取得了一定的成果[7,8]。根據組織誘導再生技術的方法,在人工骨中添加促進組織再生的細胞和物質,使喪失的組織再生,可克服傳統治療方法的某些局限性,使骨修復材料的生物活性有很大提高。本研究組織學觀察結果顯示:成骨作用 A組 ＞C組 ＞E組 ＞B、D組 ＞F組,表明 IGF-Ⅰ 、CHA、ABM三者相輔相成、相互促進；CHA/ABM成骨作用僅次于CHA/IGF-Ⅰ/ABM,表明 ABM有骨誘導能力；而CHA/IGF-Ⅰ與 CHA成骨作用比較無統計學意義,表明了單純吸附 IGF-Ⅰ的 CHA并不能顯著提高CHA的成骨效果,通過 ABM提供種子細胞才能發揮 IGF-Ⅰ骨誘導的生物學效應；在 ABM中,由于自體骨髓所能提供的成骨干細胞細胞數量極少(3 000/20 ml),所以成骨效果不理想,但與 CHA/IGF-Ⅰ、CHA相比略有優勢；而從與 CHA/ABM的比較可以看出,ABM以 CHA為載體材料更能發揮成骨效應。

將 CHA、IGF-Ⅰ及 ABM三者復合構建具有較高生物活性的組織工程化移植物,充分體現骨再生、骨誘導及骨傳導 3種機制,基本具備了理想移植材料所應有的特性。但由于本研究期限短,某些未知因素如其生物降解性能,IGF-Ⅰ附壁最佳方式及劑量,自體骨髓所能提供的成骨干細胞細胞數量極少等問題仍需進一步探索。

[1]Giannoni P,Mastrogiacomo M,Alini M,et al.Regeneration of large bone defects in sheep using bone marrow stromal cells[J].J Tissue Eng Regen Med,2008,2(5):253-262.

[2]Yao W,Zhong J,Yu J,et al.IGF-Iimproved bone mineral density and bodycomposition of weaver mutant mice[J].Growth Horm IGF Res,2008,18(6):517-525.

[3]Sarahrudi K,Mousavi M,Grossschmidt K,et al.Combination of anorganic bovine-derived hydroxyapatite with binding peptide does not enhance bone healing in a critical-size defect in a rabbit model[J].JOrthop Res,2008,26(6):759-763.

[4]Hisatome T,Yasunaga Y,Yanada S,et al.Neovascularization and bone regeneration by implantation of autologous bone marrow mononuclear cells[J].Biomaterials,2005,26(22):4550-4556.

[5]Zambonin G,Grano M,Greco G,et al.Hydroxyapatite coated with insulin-like growth factor 1(IGF1)stimulates human osteoblast activity in vitro[J].Acta Orthop Scand,1999,70(2):217-220.

[6]Ko?ter S,Tigchelaar SJ,Farla P,et al.Coralline hydroxyapatite is a suitable bone graft substitutein an intra-articular goat defect model[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2009,90(1):116-122.

[7]Silva RV,Camilli JA,Bertran CA,et al.The use of hydroxyapatite and autogenous cancellous bone grafts to repair bone defects in rats[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2005,34(2):178-184.

[8]Madry H,Kaul G,Cucchiarini M,et al.Enhanced repair of articular cartilage defects in vivo by transplanted chondrocytes overexpressing insulin-like growth factorⅠ (IGF-Ⅰ )[J].Gene Ther,2005,12(15):1171-1179.