不同種屬坐骨神經的結構差別

王 鑫,彭 江,王 玉,任志午,趙 斌,張 莉,許文靜,趙 喆,詹勝鋒,盧世璧,趙 慶

(中國人民解放軍總醫院,北京 100853)

同種異體神經移植作為修復周圍神經缺損的一種修復材料,由于具有天然的與受區一致的管狀結構和細胞外基質成分而得到關注,但其含有的抗原成分是阻止其廣泛應用主要因素。我們先前的研究中,采用了 Hudson法去除了大鼠坐骨神經中的免疫原性成分,還能更好地保留神經結構的完整性[1],但對于豬、靈長類和人這樣加大型的哺乳動物,神經明顯增粗,其結構也不盡相同[2]。2009年 1～9月,我們通過體外實驗對比觀察人、犬、豬、大鼠坐骨神經結構的差別,旨在為粗大神經的化學去細胞方法方面提供解剖學依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗設備 愛德華牌 TSJ-1A型自動組織脫水機(天津天利航空機電公司),BMJ-1型組織包埋機(天津天利航空機電公司),Leitz 1516型組織切片機(德國 Leica公司),BH-2 OLYMPUS生物顯微鏡(日本 OLYMPUS公司),實驗所需豬、犬、大鼠由解放軍總醫院動物中心提供。

1.2 神經標本制備及分組 實驗分 4組:Ⅰ組,新鮮人坐骨神經 5根；Ⅱ組,新鮮豬坐骨神經 5根；Ⅲ組,新鮮犬坐骨神經 5根；Ⅳ組,新鮮大鼠坐骨神經 5根。分別進行以下處理:無菌條件下取新鮮坐骨神經,顯微鏡下去除神經外膜上附著的脂肪組織,切取 5段長10 mm的神經段,采用 10%甲醛固定 24 h。神經固定后,流水沖洗 24 h。標本經 75%、85%、90%、95%乙醇及無水乙醇梯度脫水。標本在二甲苯溶液中進行透明處理。標本組織用石蠟包埋,橫向切片,片厚 5.0 μm。切片用二甲苯、無水乙醇 95%、85%、75%乙醇梯度脫蠟。以 Harris蘇木素液,鹽酸乙醇、95%乙醇及酸化伊紅乙醇液進行染色(HE染色)。以 95%乙醇、無水乙醇、二甲苯行脫水透明,中性樹膠封固。顯微鏡下觀察計量神經束膜厚度。Laminin免疫組化染色:橫向切片,片厚 5.0μm。 3%H2O2孵育 5～10 min,消除內源性過氧化物酶的活性,蒸餾水沖洗,PBS液浸泡5 min。滴加 0.05%胰蛋白酶適量,置于 37℃恒溫培養箱中消化 30 min,用于細胞內抗原的顯示。10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育 10 min。傾去血清,滴加適量兔抗人層黏蛋白多克隆抗體工作液。37℃孵育 60 min。PBS沖洗 3次,每次 5 min。蒸餾水充分沖洗,復染、封片,顯微鏡下觀察計量神經束膜內面積和神經面積。

1.3 分析方法 將所得切片照相,每張切片以 40倍連續拍照后使用 Photoshop圖像處理軟件將所得圖片拼接,拼接為一張完整的神經橫截面圖,分別用不同顏色標注神經纖維和神經束,根據神經束標注顏色的像素求得神經束內截面積占神經截面積百分比。使用 BH-2 OLYMPUS生物顯微鏡自帶測量軟件測得神經束膜的厚度。

1.4 統計學方法 采用 SPSS 17.0統計軟件包進行 One Anova單因素方差分析(Tamhane法),數據以±s表示,以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

HE染色所得人坐骨神經橫截面和神經束膜厚度見圖 1、2。Laminin免疫組化染色所得人坐骨神經橫截面見圖 3。各組間坐骨神經結構參數比較見表1。由表1可見,不同種屬間坐骨神經束膜厚度存在差異(F=7.48,P＜0.05),其中人坐骨神經的束膜厚度最厚,是豬的 2倍(P＜0.01),犬的 4倍(P＜0.01),大鼠的 9倍(P＜0.01)；豬坐骨神經束膜厚度是犬的 1.7倍(P=0.018),大鼠的 4倍(P=0.003)；犬坐骨神經束膜厚度是大鼠的 2.3倍(P=0.002)。不同種屬間神經束內截面積占神經截面積百分比存在差異(F=8.10,P＜0.05),人與豬間比較無統計學差異(P=0.101),人與犬、大鼠間比較有統計學差異(P=0.02,P=0.005)。

表1 各組坐骨神經結構參數比較(±s)

表1 各組坐骨神經結構參數比較(±s)

組別 束膜厚度(μm)神經束內橫截面積(×103像素)神經橫截面積(×103像素)神經束內截面積占神經截面積(%)Ⅰ組 22.40±2.30 167.40±47.50 435.7±91.6 38.42±2.43Ⅱ組 9.40±1.67 72.82±0.02 229.0±27.4 31.80±4.02Ⅲ組 5.40±2.39 119.36±4.70 218.6±5.5 54.60±6.54Ⅳ組 2.34±0.42 63.80±5.70 89.6±10.6 71.20±9.24

3 討論

周圍神經缺損的修復是醫學界尚未完全解決的難題之一。雖然目前公認自體神經移植效果最佳,但這種“拆東墻,補西墻”的辦法有其局限性,且因供體有限,常無法滿足較大神經缺損或較廣泛神經損傷修復的需要。醫學界進行了各種替代材料修復周圍神經缺損研究,未能取得令人滿意的效果。大量周圍神經損傷修復研究表明[3～5],異體神經具有來源廣泛、保持神經天然結構等其他移植物所無法比擬的優越性。化學去細胞異體神經采用化學萃取法去除神經中的抗原成分(髓鞘、軸突),制備的化學去細胞異體神經具有免疫原性弱、細胞膜殘片去除完全、神經基底膜管好等優點。我們自 1999年以來,開始了異體神經化學去細胞方面的研究,并在大小動物和初步臨床應用方面取得系列成功[6～8]。

與大鼠比較,豬、靈長類和人等加大型哺乳動物神經明顯增粗,結構也不盡相同。本研究通過體外實驗對比發現,嚙齒類小動物和大型哺乳動物坐骨神經之間的結構存在顯著差異。就坐骨神經束膜而言,人的神經束膜厚度是豬的 2倍,犬的4倍,大鼠的 9倍。束膜作為一種結構致密的纖維結締組織,是阻礙化學制劑進入神經束內的主要屏障,也是阻礙細胞殘片去除移出神經組織的屏障。因此,研究不同動物的化學去細胞異體神經的結構是選擇合適的萃取劑,確定合適的萃取濃度、萃取時間和萃取劑組合的一個基本點。萃取劑除了需要進入神經束外,還受到束膜間質的阻隔。因此粗大神經的去細胞效果不僅受到神經粗細的影響,還受到束膜間質和束膜厚度的影響。本研究表明,與人坐骨神經結構最接近的是豬的坐骨神經,在研究人的化學去細胞異體神經工藝時,可以以豬的坐骨神經為實驗對象。

[1]王冠軍,孫明學,盧世璧,等.改良化學去細胞同種異體神經制備方法的實驗研究[J].中國矯形外科雜志,2007,15(12):929-932.

[2]王鑫,王玉,彭江,等.粗大異體神經兩種化學萃取方法的比較[J].中國矯形外科雜志,2010,18(9):1300-1302.

[3]孫明學,王鑫,趙斌,等.化學去細胞法對粗大神經質量評價方法及影響因素的探討[J].中國修復重建外科雜志,2006,20(8):779-782.

[4]于海龍,彭江,孫華燕,等.化學去細胞同種異體神經復合緩釋神經生長因子修復周圍神經缺損[J].中國修復重建外科雜志,2006,20(8):779-782.

[5]Hudson TW,Liu SY,Schmidt CE.Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing[J].Tissue Eng,2004,10(9-10):1346-1358.

[6]孫明學,唐金樹,許文靜,等.化學去細胞同種異體神經移植的實驗研究[J].中華骨科雜志,2006,26(4):267-271.

[7]孫明學,盧世璧,唐金樹,等.化學去細胞異體神經修復神經缺損長度的實驗研究[J].中國矯形外科雜志,2006,14(8):603-607.

[8]郭義柱,盧世璧,王巖,等.去細胞同種異體神經移植修復人體長段周圍神經缺損[J].中國臨床康復,2005,9(38):26-27.