高效毛細管電泳法測定新疆紫草中左旋紫草素的含量

白 研，毋福海，羅碧蓮，曾春麗

（廣東藥學院公共衛(wèi)生學院，廣州市 510310）

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma.(Royle)Johnst.或內(nèi)蒙紫草 Arnebia guttata Bunge的干燥根[1，2]。前者習稱“軟紫草”，后者習稱“硬紫草”。其中新疆紫草更為常用，其味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有涼血、活血、解毒透疹等功效。臨床常用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、皰癢、陰道炎、嬰兒皮疹、水火燙傷等，具有很強的抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、保肝和調(diào)節(jié)免疫等作用[3]。紫草根部含有萘醌類色素，包括紫草素、乙酰紫草素、丙烯酰紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素等多種色素成分，多以左旋紫草素的含量作為紫草提取物的檢測標準。文獻報道左旋紫草素的測定方法有薄層掃描法[4]、高效液相色譜法[5～7]等。以毛細管電泳法進行測定，相關報道[8]為采用高頻電導檢測器，而電化學檢測普遍存在的弱點為重現(xiàn)性較差，以此作為藥材的質(zhì)量控制方法較為不利。本試驗采用紫外檢測器，通過改善一系列電泳條件，建立了對新疆紫草中左旋紫草素分離、測定的高效毛細管電泳（HPCE）法。

1 材料

1.1 儀器

CL1030型HPCE儀（北京彩陸科學儀器有限公司）；K-2501型紫外-可見檢測器（德國諾爾公司）；HW-2000型色譜工作站（2.17版，南京千譜軟件有限公司）；pHS-3C型精密酸度計（上海虹益儀器儀表有限公司）；DL-360型超聲波清洗器（寧波市石浦海天電子儀器廠）。

1.2 試藥

左旋紫草素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0769-9903）；新疆紫草藥材購自北京同仁堂，經(jīng)廣東藥學院中藥學院孟江副教授鑒定為真品；所用試劑為優(yōu)級純或分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備液 精密稱取左旋紫草素對照品9.0 mg，加適量甲醇溶解后定容至25 mL，即得（360.0 μg·mL-1），4 ℃貯藏。臨用時稀釋成各濃度的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取適量干燥的紫草粉末，置于50 mL錐形瓶中，加甲醇25 mL，準確稱量，超聲30 min，放冷，補充甲醇至初始質(zhì)量，搖勻，過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.2 電泳操作條件

采用未涂層彈性融硅石英毛細管（53 cm×50 μm ID，有效長度46 cm），運行電壓14 kV，重力虹吸方式進樣，高度25 cm，進樣時間15 s，紫外檢測波長516 nm。試驗在恒溫（25℃）、恒濕（60%）條件下進行。

毛細管在使用前，依次用二次蒸餾水沖洗10 min、0.1 mol·L-1NaOH溶液沖洗5 min、二次蒸餾水沖洗5 min、運行緩沖溶液沖洗10 min，所需電泳緩沖液均經(jīng)過超聲脫氣20 min。在2次運行之間，用運行緩沖溶液沖洗2 min。

2.3 電泳條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖溶液的選擇 試驗考察了Tris-鹽酸（pH 7.0～9.0）、Tris-H3BO3（pH 7.5～9.0）、Na2HPO4-NaH2PO4（pH 6.6～7.8）、硼砂-HAc（pH 7.0～8.5）、H3BO3-三乙胺（pH 7.5～9.2）、H3BO3-二乙胺（pH 7.5～9.2）緩沖體系。此外，還檢測了Tris-檸檬酸（pH 7.0～9.0）、H3BO3-硼 砂（pH 7.4～9.0）、H3BO3-NaCl-硼砂（pH 7.0～9.2）、硼砂-KH2PO4（pH 7.0～9.2）、硼砂-Na2CO3（pH 9.2～1.0）、硼砂（pH 9.2）對樣品中左旋紫草素分離效果的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在H3BO3-二乙胺和H3BO3-三乙胺緩沖體系中，左旋紫草素出峰相對較好。又比較H3BO3-二乙胺和H3BO3-三乙胺2種緩沖體系，發(fā)現(xiàn)在H3BO3-二乙胺緩沖體系中，背景噪聲和拖尾因子較大；在H3BO3-三乙胺緩沖體系中，左旋紫草素與其衍生物的分離效果較好，基線平穩(wěn)，故最終選用了H3BO3-三乙胺緩沖體系。

由于考慮到運行緩沖液的濃度及配比影響被測物的分離度與遷移時間，故試驗中利用正交試驗法考察了H3BO3與三乙胺不同濃度及配比對左旋紫草素及其衍生物分離情況的影響，得出2.0 mmol·L-1H3BO3+6.0 mmol·L-1三乙胺的緩沖體系分離效果最佳。

2.3.2 有機改性劑的選擇 在電泳過程中，緩沖溶液中加入有機溶劑可以影響介質(zhì)黏度、介電常數(shù)及雙電層結構等，進而影響電滲流及遷移行為，達到調(diào)節(jié)選擇性、改善分離度的目的[9]。試驗中考察了乙醇、甲醇、丙二醇、丙酮、β-環(huán)糊精（β-CD）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等幾種添加劑不同加入量對分離和檢測的影響，發(fā)現(xiàn)緩沖溶液中加入β-CD時，可使左旋紫草素峰形變得尖銳，峰高、峰面積明顯增大。比較加入不同濃度的β-CD對左旋紫草素分離的影響，發(fā)現(xiàn)加入5.0 mmol·L-1β-CD分離效果最好，其它幾種添加劑對分離檢測無改善。因此，后續(xù)試驗選擇添加 5.0 mmol·L-1β-CD 的 2.0 mmol·L-1H3BO3+6.0 mmol·L-1三乙胺緩沖體系（pH 8.9）作為電泳介質(zhì)。

2.3.3 分離電壓和進樣時間的選擇 試驗考察了8.0～23.0 kV電壓范圍內(nèi)樣品的分離情況，綜合考慮分離度、分離時間、峰展寬、靈敏度、噪聲等因素，優(yōu)化選擇14 kV為分離電壓。

進樣時間決定了進樣量的大小，時間太短會影響檢測的靈敏度，時間太長又會影響分離效率和分離度。本試驗以重力進樣，進樣高度為25 cm，在14 kV分離電壓下，考察了進樣時間對分離效果的影響，選擇最佳進樣時間為15 s。

在上述優(yōu)化試驗條件下的電泳圖見圖1。

圖1 毛細管電泳圖A.對照品；B.紫草；1.左旋紫草素；2.甲醇；3.未知物Fig 1 Capillary electrophoretogramA.control substance；B.A.euchroma；1.shikonin；2.methanol；3.unknown substances

2.4 精密度試驗

在優(yōu)化電泳條件下，分別取10.8、25.2 μg·mL-12種濃度的左旋紫草素對照品溶液，各重復進樣6次，測定峰面積。結果，RSD分別為1.60%、1.63%，表明儀器精密度良好。

2.5 線性關系考察

取適量對照品貯備液，分別加甲醇稀釋成含左旋紫草素7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8、36.0 μg·mL-1的系列標準溶液，在優(yōu)化電泳條件下重力進樣測定。以對照品峰面積積分值（Y）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝578.24C－431.18（r＝0.9990）。結果表明，左旋紫草素檢測濃度在7.2～36.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關系。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取紫草藥材粉末0.9 g，加甲醇25 mL，按“2.1.2”項下方法處理后稀釋2倍，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按優(yōu)化電泳條件分析測定。結果，RSD＝0.85%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測定結果穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取0.050 g紫草藥材粉末6份，將左旋紫草素對照品按3種水平分別加入紫草樣品中，各平行2份，按“2.1.2”項下方法處理后在優(yōu)化電泳條件下進樣分析，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測定

精密稱取適量紫草粉末，平行6份，以甲醇為溶劑，液料比為50∶1，室溫下超聲30 min，按照“2.1.2”項下方法分別制備供試品溶液，在優(yōu)化電泳條件下分別測定。結果，樣品中左旋紫草素的平均含量為3.85 mg·g-1，RSD＝2.32%。

3 討論

本試驗以紫外檢測器建立了測定左旋紫草素的HPCE法。通過對緩沖溶液組成、pH值、濃度、添加有機改性劑以及分離電壓和進樣時間對左旋紫草素與其衍生物分離情況的影響研究，確立了實現(xiàn)左旋紫草素與其衍生物有效分離的HPCE條件。在此條件下，左旋紫草素保留時間約為5 min，與相關文獻[8]比較分離時間縮短。

試驗中供試品溶液是以甲醇為溶劑、超聲提取紫草樣品而得，經(jīng)正交試驗優(yōu)化左旋紫草素提取工藝條件，在此條件下左旋紫草素含量為3.85 mg·g-1，與相關文獻[10]比較測定含量相符，但本試驗以甲醇為溶劑提取左旋紫草素使收率有一定提高。

[1]唐漢均，王春麗.麻油提取紫草工藝條件優(yōu)選[J].上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（11）：58.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業(yè)出版社，2005：238.

[3]李曉瑾，譚秀芳，馬 媛，等.藥用植物紫草的研究進展[J].新疆師范大學學報，2005，24（4）：69.

[4]劉 芳，王小平，伍偉禎.薄層掃描法測定燒傷膏中左旋紫草素的含量[J].基層中藥雜志，2001，15（2）：21.

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[6]郭紅軍，簡麗娜，孔煥宇，等.高效液相色譜法測定玉紅膏中紫草素的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（4）：489.

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[10]白 研，宋粉云，毋福海，等.正交試驗優(yōu)選紫草提取工藝[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（4）：288.