胰高血糖素受體siRNA對糖尿病模型小鼠的降糖作用研究

周潔，彭金良，徐宇虹#（.上海交通大學藥學院分子藥劑學實驗室，上海市 200240；2.上海交通大學生命科學技術學院，上海市 200240）

對于2型糖尿病病癥，胰高血糖素受體（GCGR）與胰高血糖素之間的相互作用對于血糖調節具有重要意義。一方面，胰高血糖素可促進糖異生和糖原分解；另一方面，胰高血糖素可間接影響胰島素分泌情況。因此通過抑制GCGR發揮作用可以緩解高血糖癥狀。有研究[1]發現GCGR的基因敲除后模型小鼠中血糖濃度明顯降低，并且小鼠的糖耐量得到了很好的提高，這一發現也證實了GCGR在降糖中的重要地位。

為了達到降糖的目的，需要有效的手段以抑制肝臟中GCGR的表達。近年來小分子藥物GCGR拮抗藥被報道具有很好的降糖穩定作用[2]；GCGR的反義抑制核苷酸也被證實能夠有效地改善糖尿病模型小鼠的高血糖癥狀[3]。而近年來，siRNA類藥被認為是一種更有效的抑制特定基因表達的藥物，具有極大的應用前景[4]。基于此，在本研究中，筆者設計和研發了針對糖尿病小鼠模型GCGR的siRNA，考察了經高壓快速靜脈注射系統給藥后，siRNA類藥在緩解模型小鼠血糖癥狀中的作用情況。

1 材料

Milli-Q型純水機（美國Millipore公司）；BS210S電子天平（德國Sartorius公司）；UV-21.2PC可見-紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；pHS-2S型數顯酸度計（上海天達儀器有限公司）；Centrifuge 5415R離心機（德國Eppendorf公司）；BCM-100生物潔凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DK-S24電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）。

四氧嘧啶（Alloxan monohydrate，美國Sigma公司，色譜純）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物技術有限公司，批號：20030101）；靶向GCGR的3條長度為21 bp的siRNA雙鏈序列（上海吉瑪制藥技術有限公司，色譜純化單鏈凍干粉，純度：＞97%）；焦磷酸二乙酯（DEPC）處理除去RNA酶的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，自制）。

健康昆明鼠，♂，6周齡，體質量30 g左右，由上海斯萊克試驗動物責任有限公司提供（許可證號：SCXK（滬）-2007-0005）。于上海交通大學藥學院實驗動物中心20℃明暗交替環境中適應性預培養1周后進行實驗。

2 方法與結果

2.1 siRNA設計合成

設計針對小鼠GCGR的siRNA。根據GCGR的refseq序列NM_008101，根據siRNA設計原理，使用siRNA設計軟件[5]，設計格式為AA19NTT、長度為21 bp的siRNA。挑選3條分別靶向于GCGR基因不同位點的siRNA，結果如下：GCGR siRNA-1靶序列AAAGCTCTTCAGGAGGAAAGGTT（GCGR基因1451～1473 bp處），正義鏈5′-AGCUCUUCAGGAGGAAAGGUU，反義鏈3′-UUUCGAGAAGUCCUCCUUUCC；siRNA-2靶序列AAAGTGCAGCACCGCCTAGTGTT（455～477 bp處），正義鏈5′-AGUGCAGCACCGCCUAGUGUU，反義鏈3′-UUUCACGUCGUGGCGGAUCAC；siRNA-3靶序列AACTACATCCATGGGAACCTGTT（707～729 bp處），正義鏈 5′-CUACAUCCAUGGGAACCUGUU 反義鏈 3′-UUGAUGUAGGUACCCUUGGAC。對照組非靶向性siRNA正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反義鏈3′-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA。siRNA的合成均由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。

將合成得到的4條siRNA序列用DEPC處理過的pH7.4、平衡后的PBS溶解，濃度為1 nmol·mL－1，備用。整個實驗操作過程在無菌操凈臺上進行，移液槍槍頭耗材等均使用DEPC處理過。

本文中數據處理以及作圖采用Microsoft Office Excel 2003，組內標準差計算采用Excel標準計算函數Stdev。

2.2 糖尿病模型小鼠以及血糖檢測方法的建立

2.2.1 糖尿病模型小鼠建立及其健康狀況監測。本研究中采用2%（W%）四氧嘧啶/PBS誘導建立小鼠糖尿病模型：取小鼠20只，適應飼養環境1周并測正常小鼠空腹4 h后的體質量以及血糖含量；小鼠禁食不禁水12 h后，配制新鮮的四氧嘧啶誘導劑溶液，給藥方式為一次性腹腔注射（ip），劑量為200 mg·kg－1（體質量）。注射完畢后為小鼠補充飲水以及食物，并且更換墊料。注射誘導劑72 h后，測量空腹4 h以后的小鼠體質量以及血糖含量，檢測建模成功率并且進行分組。20只小鼠誘導前血糖含量均值為（7.1±3.0）mmol·L－1，誘導后死亡2只，血糖含量大于15 mmol·L－1的小鼠共12只，血糖含量均值（34.6±3.9）mmol·L－1，誘導建模成功率為60%。

將12只建模成功后的小鼠分為4組，每組3只，各組血糖含量平均值分別為A組（38.4±3.3）mmol·L－1、B組（29.2±4.6）mmol·L－1、C 組（34.8±3.8）mmol·L－1、D 組（36.1±2.1）mmol·L－1。

建模后16 d內，檢測各組小鼠體質量情況以了解其健康狀態，結果見表1。

表1 建模后不同時間各組小鼠體質量變化數據（g，，n＝3）Tab 1 Changes of body weight of mice after modeling（g，，n＝3）

表1 建模后不同時間各組小鼠體質量變化數據（g，，n＝3）Tab 1 Changes of body weight of mice after modeling（g，，n＝3）

1631.2±2.636.4±2.236.9±4.031.5±3.4組別A組B組C組D組時間/d 033.9±0.533.6±3.431.5±0.732.6±1.5124835.4±4.333.9±1.934.8±3.831.2±1.932.4±1.934.1±3.031.8±2.530.1±1.631.1±0.833.4±2.932.3±3.730.5±1.131.7±1.835.9±2.734.8±3.732.3±0.61230.5±1.936.5±2.237.9±4.529.5±0.4

由表1可知，誘導后糖尿病模型小鼠體質量較為穩定，健康狀態良好。

2.2.2 血糖含量檢測方法的建立。小鼠禁食不禁水4 h后，盡量保持小鼠情緒平靜，迅速用毛細玻璃管于小鼠眼底取血100 μL左右（3～4滴血），置于0.5 mL離心管中。血液樣本于4℃冰箱中冷藏放置至離心管底部出現血液凝結后，立即于4℃離心（3000 r·min－1，5 min），取上層血清作葡萄糖含量檢測。

將葡萄糖檢測試劑盒中的R1、R2工作液等比例混合作為測試液。取血清樣本4μL加入1 mL的測試液中，充分混勻，立即置于37℃電熱恒溫水槽中放置15 min，使之顯色。在紫外波長505 nm處，以空白測試液加蒸餾水作對照調零，讀取樣本管的吸光度值。同時，制備5～30 mmol·L－1梯度濃度的葡萄糖標準液，制作吸光度值-葡萄糖濃度標準曲線從而讀取樣本的葡萄糖濃度。

本實驗條件下葡萄糖系列濃度回歸方程為葡萄糖濃度（mmol·L－1）＝59.265×吸光度值－2.250（R2＝0.9962），按照此回歸方程可測算血液中的葡萄糖濃度。

2.3 小鼠給予siRNA后血糖含量及糖耐量實驗

2.3.1 給藥。造模成功后，模型小鼠正常飼養第2天，按照“2.2.1”項下分組情況分別給藥：A組siRNA-1，B組siRNA-2，C組siRNA-3，D組非靶向性siRNA。

取“2.1”項中濃度為1 nmol·mL－1的4種siRNA溶液，按照溶液體積為小鼠體質量的10%進行給藥，例如，1只體質量為30 g的小鼠給藥劑量約為3 nmol siRNA物；給藥劑量參考文獻[6]，進行小鼠肝靶向體內靜脈給藥實驗。給藥方式采用尾靜脈高壓快速推注法一次性給藥；給藥完畢后密切觀察小鼠，及時補充水和飼料。

2.3.2 給藥后血糖含量-時間變化情況。分別于給藥后第1、2、4、8 d時按照“2.2.2”項下方法測量4組中各小鼠血糖含量，得到不同siRNA序列給藥后小鼠血糖含量變化曲線，見圖1。

圖1 給藥后不同時間各組小鼠血糖含量變化Fig 1 Level of blood glucose in diabetic rats at different time points after treatment

由圖1可見，A組給藥后第1天血糖含量（5.4±1.5）mmol·L－1，與給藥前比較降低了86.0%，此后的幾天內血糖含量有所回升，但第8天血糖含量依然低于給藥前血糖，為（11.7±3.5）mmol·L－1，與給藥前比較降低了69.4%；B組給藥后第1天血糖含量（17.1±1.4）mmol·L－1，與給藥前比較降低了41.4%，此后的幾天血糖含量回升；C組給藥后第1天血糖含量（27.1±7.8）mmol·L－1，與給藥前比較降低了22.2%，此后的幾天血糖回升；D組給藥后第1天血糖含量（37.8±4.2）mmol·L－1，與給藥前比較升高了4.7%，此后的幾天血糖逐漸升高，第8天時與給藥前比較升高了32%。

2.3.3 糖耐量試驗。在siRNA給藥后第2天，所有4組小鼠禁食4 h后取血測血糖含量，并定為零時刻數據，ip葡萄糖，劑量為2 g·kg－1。于給糖后30、60、90、120 min時間點分別取血測量4組小鼠血糖含量，得到血糖含量-時間曲線，見圖2。

圖2 腹腔注射葡萄糖后不同時間點各組小鼠血糖含量變化Fig 2 Level of blood glucose in diabetic rats at different time points after intraperitoneally injected with glucose

計算得出A、B、C、D 4組血糖含量-時間曲線下面積（AUC）分別為964.5、3216.1、2606.9、4173.9 min·mmol·L－1。此值可反映小鼠對葡萄糖的利用程度，AUC的值越小，證明其越能有效地利用葡萄糖。其中A、B、C組的AUC值分別為D組的23.11%、77.1%、62.5%。

3 討論

通過對給藥后模型小鼠血糖含量的監測，證實siRNA對模型小鼠具有一定的緩解高血糖癥狀的效果。其中，siRNA-1的降糖效果最為顯著，給藥后第1天血糖含量與給藥前比較降低達86.0%，siRNA-2和siRNA-3也有不同程度的降糖作用，并以在給藥后第1天作用最明顯，第3天后血糖含量有所回升，這可能與siRNA在小鼠體內發生降解有關。此外，siRNA-1在給藥后8 d內血糖并未回升到給藥前水平，這可能是siRNA-1給藥后具有改善小鼠機體功能的作用，引發了小鼠體內自主降糖的生理過程所致。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3對模型小鼠的不同降糖作用說明，針對GCGR基因的不同位點進行轉錄后可能產生各異的作用。

在糖耐量實驗中，由AUC結果可知，siRNA給藥后與對照組比較能更好地改善小鼠利用葡萄糖情況，說明siRNA不僅能夠有效地緩解高血糖癥狀，還能夠改善糖尿病小鼠對于葡萄糖的生物利用率，該過程機制還需要進一步的研究。

[1]Gelling RW，Du XQ，Dichmann DS，et al.Lower blood glucose，hyperglucagonemia，and pancreatic cell hyperplasia in glucagon receptor knockout mice[J].PNAS，2003，100（3）：1438.

[2]Unson CG.Glucagon and the glucagon receptor：merrifield years at the interface of chemistry and biology[J].Int J Pept Res Ther，2007，13（1）：19.

[3]Sloop KW，Cao JX，SieskyAM，et al.Hepatic and glucagon-like peptide-1 mediated reversal of diabetes by glucagon receptor antisense oligonucleotide inhibitors[J].J Clin Invest，2004，113（11）：1571.

[4]Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806.

[5]Jagla B，Aulner N，Kelly PD，et al.Sequence characteristics of functional siRNAs[J].RNA，2005，11（6）：864.

[6]Song E，Lee SK，Wang J，et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J].Nat Med，2003，9（3）：347.