HPLC法測定金頂側耳中延胡索酸的含量

劉佳，樸惠順，施溯筠，張善玉（長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，延吉市 133000）

金頂側耳（Pleurotm citrinopileatus Sing.）隸屬于側耳科（Pleurotaceae）側耳屬，又稱金頂蘑、榆黃蘑、榆黃菇、玉皇蘑，是一種富含蛋白質、氨基酸和維生素等多種營養成分的食藥用菌[1，2]。現代研究表明，其還含有延胡索酸、D-甘露醇、麥角甾醇、洛伐他汀和多糖等生物活性成分[3，4]。其中，延胡索酸具有抗腫瘤、抗菌、抗電休克、鎮痛、鎮咳、平喘等活性[2]。目前，對金頂側耳中延胡索酸含量測定方法的報道較少。因此，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定了金頂側耳中延胡索酸的含量，以期為金頂側耳的質量控制提供試驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測器、AT-330柱溫箱（日本島津公司）；N2000色譜工作站（浙江大學智達信息工程有限公司）；KQ2200型數控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

延胡索酸標準品（德國Augsburg公司，批號：20071129）；金頂側耳為吉林省關東大嫂食品有限公司（Ⅰ）、吉林省撫松華冠參茸有限公司（Ⅱ）、集安市新開河有限公司（Ⅲ）、吉林延邊參茸工貿有限公司（Ⅳ）和延邊豐義土特產有限公司（Ⅴ）產品，由延邊大學劉永鎮教授鑒定均為金頂側耳P.citrinopileatus Sing.的干燥子實體；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：大連依利特C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調pH 2.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：216 nm；柱溫：25 ℃。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.延胡索酸標準品；B.供試品Fig 1 HPCLchromatogramsA.standard fumaric acid；B.test sample

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準品溶液：精密稱取延胡索酸標準品適量，加無水乙醇溶解，制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液：取金頂側耳子實體，60℃下干燥4 h，粉碎過40目篩，精密稱取藥粉0.5 g，加60%乙醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，轉移至25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取標準品溶液（80 μg·mL-1）2、5、10、15、20μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積積分值。以進樣量（X，ng）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝3511.9X－66841（r＝0.9999）。結果表明，延胡索酸進樣量在0.6～1.6 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

取同一標準品溶液，按上述色譜條件重復進樣5次，測定峰面積。結果，RSD＝0.88%，表明儀器精密度較好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h各測定1次峰面積。結果，RSD＝1.75%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。結果，延胡索酸的含量分別為0.44%、0.44%、0.45%、0.44%、0.44%和0.43%，平均含量為0.44%，RSD＝1.53%，表明方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批樣品6份，精密稱取0.25 g，分別加入一定量的延胡索酸標準品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，計算樣品含量及加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取5批樣品，經干燥、粉碎后分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，進樣10μL，用峰面積外標法測定含量。結果，樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中延胡索酸含量分別為0.64%、0.47%、0.53%、0.38%、0.44%。

3 討論

本試驗分別以無水乙醇、80%乙醇、60%乙醇和40%乙醇作為提取溶劑平行操作。結果發現，60%乙醇和40%乙醇的提取效果相對較高且相差不大，但40%乙醇提取出的水溶性雜質較多，故選用60%乙醇為提取溶劑。

取樣品粉末適量，精密稱定，分別加入60%乙醇，采用不同時間（15、30、60 min）超聲提取樣品，考察提取時間。結果表明，提取30 min和60 min的含量基本一致，故采用超聲提取30 min。

筆者曾試用乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（20∶80，用磷酸調pH 2.5）[5]、乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（10∶90，用磷酸調pH 2.5）、乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調pH 2.5）、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（20∶80，用磷酸調pH 2.5）[6]、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（10∶90，用磷酸調pH 2.5）和甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調pH 2.5）6種流動相，結果以甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調pH 2.5）為流動相，延胡索酸出峰時間適中（約9.5 min），與周圍雜質峰分離較好，且節約了價格較貴的色譜甲醇的用量，降低了成本，故選用該流動相進行試驗。

本試驗建立的以HPLC法測定金頂側耳中延胡索酸含量的方法，簡便、準確、重復性好。對長白山地區5個不同生產公司的樣品進行測定的結果表明，不同金頂側耳干燥子實體中延胡索酸含量在0.38%～0.64%之間，含量差異較小。因金頂側耳的產地除長白山地區外，還有黑龍江、遼寧、河北、廣東、西藏等地[7]，而此次所測定的金頂側耳僅為長白山地區采集，因此有必要作進一步研究，以確定更為合理的含量限度范圍。

[1]謝福泉，羿 紅，蘭家細，等.金頂側耳子實體營養成分分析[J].食用菌學報，2007，14（2）：81.

[2]張 影，包海鷹，李 玉.珍貴食藥用菌金頂側耳研究現狀[J].吉林農業大學學報，2003，25（1）：54.

[3]包海鷹，張 影，圖力古爾，等.金項側耳化學成分的研究[J].菌物學報，2004，23（2）：262.

[4]劉賢銘.真菌多糖的抗腫瘤研究及臨床應用評價[J].中國藥房，2006，17（8）：629.

[5]廖建春.高效液相色譜法測定七葉蓮膠囊中延胡索酸的含量[J].藥學與臨床研究，2007，15（5）：421.

[6]游勇基，程廣強.HPLC法測定腫節風中延胡索酸的含量[J].中國中藥雜志，1997，22（9）：554.

[7]圖力古爾，李 玉.我國側耳屬真菌的種類資源及其生態地理分布[J].中國食用菌，2001，20（5）：8.