烏頭類中藥中藥效指標成分的確定及含量測定Δ

劉永剛，劉倩，張宏桂，喬延江#（.北京中醫藥大學中藥學院，北京市 000；.華北煤炭醫學院，唐山市 06003）

含烏頭堿中藥為常用中藥，如《中國藥典》收載的川烏、附子等[1]，該類中藥中生物堿成分既是其活性成分，也是毒性成分。該類中藥大都以炮制入藥，其質量優劣直接影響療效和用藥安全。然而，由于標準品的缺乏和儀器的限制，即使《中國藥典》通過限定烏頭堿的最低檢測量來控制該類中藥的質量，并通過減少使用量的方法來控制其安全，但中毒事件仍屢有發生[2]。基于此，筆者以附子為研究對象，針對《中國藥典》對烏頭類中藥飲片及制劑只設質量控制的安全指標而無藥效指標，導致此類有毒中藥制劑安全減效的問題進行了研究，在初步確定新烏頭次堿為藥效指標成分的基礎上，提出用烏頭堿作為毒性指標成分、新烏頭次堿作為藥效指標成分，以雙指標質量控制方案來確保烏頭類中藥的安全、有效。由于烏頭堿作為毒性指標成分的研究方法比較成熟，本試驗著重對如何確定新烏頭次堿為藥效指標成分和新烏頭次堿的含量測定方法進行研究。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）系統，包括在線真空脫氣機、二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；HP Chemstation RVA0.803色譜工作站（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純；附子購自四川江油，由北京中醫藥大學譚鈺元教授鑒定為真品；新烏頭次堿標準品（筆者自制，經HPLC法測定含量＞98%）。

2 方法與結果

2.1 藥效指標成分的確定

2.1.1 新烏頭次堿的鑒定 通過質譜、紫外、1H-NMR和13C-NMR確定為新烏頭次堿，并用HPLC法測定其純度＞98%。

2.1.2 附子中生物堿的含量測定 用LC-MSn法對附子中生物堿成分進行初步鑒定，并根據其離子強度大小初步判定新烏頭次堿在烏頭類生物堿中含量最高。

2.1.3 附子入血成分的鑒定 通過給家兔灌服附子后，用LC-MSn法檢測入血成分，發現新烏頭次堿為入血成分。

“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”項詳細內容另文發表。

2.1.4 烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭次堿受熱穩定曲線的變化 將4種生物堿在100℃下進行加熱，用HPLC分析峰面積的變化。4種生物堿受熱穩定曲線的變化見表1。

表1 4種生物堿受熱穩定曲線的變化Tab 1 Stability curves of 4 kinds of alkaloids in heated condition

2.2 新烏頭次堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zobax XDB C1（8250 mm×2.1 mm，5 μm）；檢測波長：240 nm；流動相：0.01%氨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（） ；柱溫：25 ℃；流速：1 mL·min-1。色譜見圖1。

2.2.2 溶液的制備 （1）標準品貯備液：精密稱取新烏頭次堿標準品2.5 mg，加0.01%鹽酸-甲醇制成每1 mL含新烏頭堿0.51 mg的溶液，作為標準品貯備液。（2）供試品溶液：取樣品粉末（過20目篩）1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加10%氨水1 mL浸潤，再精密加入乙醚25 mL，超聲提取30 min，吸取上清液，殘渣用乙醚洗滌3次，每次5 mL，合并提取液與洗滌的乙醚液，50℃水浴揮干乙醚，用0.01%鹽酸-甲醇10 mL溶解，過0.45 μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液[3]。

2.2.3 線性關系考察 精密吸取標準品貯備液0.5、1、1.5、2 mL，分別置于10 mL量瓶中，用0.01%鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列標準溶液。精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定。以峰面積積分值（X）為橫坐標，進樣量（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝304.5X－3.53（r＝0.9998）。結果表明，新烏頭次堿進樣量在0.51～10.2 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復進樣5次。結果，新烏頭次堿峰面積的RSD＝0.51%，表明方法精密度良好。

2.2.5 穩定性考察 精密吸取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別在0、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，測定。結果，新烏頭次堿峰面積的RSD＝1.35%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一附子藥材粉末6份，每份1.0 g，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分析測定。結果，新烏頭次堿平均含量的RSD＝1.4%，表明方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取附子樣品6份（其新烏頭次堿的含量為0.354 mg·g-1），分別精密加入新烏頭次堿標準品貯備液適量，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.2.8 檢測限的測定 按信噪比為3∶1計算，本試驗條件下新烏頭次堿的檢測限按進樣量計為1.5 ng。

2.2.9 樣品含量測定 取3個批次的樣品，分別按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，重復進樣3次，取平均值按回歸方程計算含量，結果見表3。

表3 不同批次炮制附子中新烏頭次堿的含量（n＝3）Tab 3 Content of benzoylmesaconine in different bathes of processedA.carmichaeli（n＝3）

3 討論

本試驗通過化合物的含量測定及是否為入血成分、標準物穩定性性質研究，初步建立了確定烏頭類中藥中藥效指標成分的方法，這為其它中藥如何選擇標準品提供了方法上的借鑒。

若按照《中國藥典》規定的方法操作，烏頭類生物堿含量過低、炮制過度甚或烏頭類中藥偽品或贗品均較容易通過質檢并作為藥用，這務必會降低成藥的療效。因此，增加新烏頭次堿含量控制項是合理、有效的，可用于加強烏頭類中藥的質量控制。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：132.

[2]陳 幸，夏文娟，方娜娜.對《中國藥典》附子中烏頭堿限量檢查的商榷[J].藥物分析雜志，1995，15（4）：6.

[3]劉 芳，于向紅，李 飛.HPLC測定附子及其炮制品中3種雙酯型生物堿的含量[J].中國中藥雜志，2006，31（14）：1160.