復方鉀鈣鎂液中細菌內毒素檢查法的可行性研究

蔡 慎，鄭英麗，陳寶玲，方 麗

（中國醫學科學院阜外心血管病醫院藥劑科，北京市 100037）

1975年St.Thomas首次將心臟停跳液引入臨床[1，2]，我院在此基礎上于1980年研制出復方鉀鈣鎂液，用于心臟直視手術前的心臟停跳。經20余年臨床實踐證明，該液未見明顯不良反應，廣泛應用于心外科手術中。目前國家對于注射劑質量高度關注，《化學藥注射劑安全性檢查法應用指導原則》規定注射劑均應設細菌內毒素（或熱原）檢查項。為了更有效地控制制劑質量，保證臨床用藥的安全，本文對該液進行了細菌內毒素檢查的方法學研究，以期為建立其內毒素檢查方法提供依據，同時也希望能為其他同類制劑的質量控制提供參考。

1 材料

鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號：0802290，規格：每支0.1 mL，靈敏度：0.25 EU·mL－1；湛江安度斯生物有限公司，批號：0806181，規格：每支0.1 mL，靈敏度：0.25 EU·mL－1；湛江安度斯生物有限公司，批號：0903131，規格：每支0.1 mL，靈敏度：0.03 EU·mL－1）；細菌內毒素工作標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-200963，規格：每支120 EU）；細菌內毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號：090511，規格：每支2 mL，內毒素含量：＜0.005 EU·mL－1）；復方鉀鈣鎂液（自制，批號：20090305、20090326、20090423，規格：每支10 mL，含氯化鉀0.3725 g、氯化鈣0.145 g、氯化鎂1.625 g）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

按照《中國藥典》2005年版二部附錄細菌內毒素檢查法[3]規定，根據鱟試劑標示靈敏度，將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混合15 min，然后，制備成2、1、0.5、0.25 λ 4個濃度的內毒素標準溶液。同時用細菌內毒素檢查用水2支作為陰性對照管（記作NC）。鱟試劑靈敏度復核結果見表1。

從表1可見，3批鱟試劑靈敏度的測定值（λc）均在0.5～2.0 λ范圍內，表明各批鱟試劑靈敏度符合規定。

2.2 細菌內毒素限值的確定

按公式L＝K/M[3]，K為人用每kg體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K＝5 EU·（kg·h）－1。M為以成人用每kg體質量每小時的最大供試品劑量，人均體質量按60 kg計算。本品在臨床使用中，于500 mL生理鹽水中加入本品10～20 mL，將其向心肌灌注。時間以1 h計；因此用藥的最大劑量M＝0.33 mL/（kg·h）－1，計算得內毒素限值L為L＝K/M＝5/0.33＝15 EU·mL－1。因本品與大輸液聯合使用，為保證臨床應用的安全性，根據復方、輸液、工藝易污染者從嚴原則，加上安全系數。在上述計算限度基礎之上將限度要求提高3～10倍[4，5]，因此將本品L值定為1.5 EU·mL－1。

2.3 干擾預試驗

2.3.1 復方鉀鈣鎂液有效稀釋倍數（MVD）的計算。用MVD＝CL/λ來確定MVD，其中L為復方鉀鈣鎂液的細菌內毒素限值1.5 EU·mL－1，λ為鱟試劑的標示靈敏度，目前購買到的鱟試劑靈敏度（λ）的范圍一般在0.03～0.5 EU·mL－1，則本品的最大有效稀釋倍數為3～50倍。

2.3.2 試驗操作。將復方鉀鈣鎂液用細菌內毒素檢查用水分別稀釋為3、6、12、24倍稀釋液，將此系列稀釋溶液記為NPC。根據使用鱟試劑的靈敏度，在上述試驗溶液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2 λ濃度的細菌內毒素，記此系列溶液分別為PPC。取靈敏度為0.25 EU·mL－12個不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC和NPC進行反應，每一倍數重復2管，并另取細菌內毒素檢查用水和含2 λ的內毒素溶液分別作2支陰性對照（NC）管和陽性對照（PC）管。進行3個批號樣品預干擾試驗，結果見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果Tab 2 Results of interference pretest for samples

預試驗結果初步表明，2個廠家的鱟試劑對3批樣品的細菌內毒素的試驗結果均在供試品6倍及其以上稀釋倍數時對鱟試劑的凝膠化反應不存在干擾作用。

2.4 干擾試驗

為了最終確認是否存在干擾因素的影響，進行以下正式干擾試驗。取復方鉀鈣鎂液用細菌內毒素檢查用水分別進行稀釋，使其最終干擾試驗稀釋倍數為6倍，按《中國藥典》2005年版二部附錄中的“細菌內毒素檢查供試品干擾試驗項”[3]進行試驗，結果見表3。

表3 樣品干擾試驗結果Tab 3 Results of interference test for samples

由表3可見，3個批號復方鉀鈣鎂液對2個廠家鱟試劑的干擾試驗結果，最大濃度2.0 λ管結果均為陽性，最低濃度0.25 λ管結果均為陰性；對于λ＝0.25 EU·mL－1的2組鱟試劑的Es均為0.25 EU·mL－1，在0.5～2.0 λ范圍內，3個批號樣品測得的的Et值均在0.5 Es～2.0 Es范圍內，結果表明該樣品進行6倍稀釋后，對不同廠家的鱟試劑與內毒素的反應均無干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用細菌內毒素檢查法。

2.5 細菌內毒素半定量分析方法的確立

本品經過干擾試驗驗證稀釋6倍后無干擾。計算：MVD＝CL/λ＝1.5/0.03＝50倍。用細菌內毒素檢查用水將本品分別稀釋為6、12、24、48倍。用靈敏度λ為0.03 EU·mL－1的鱟試劑作內毒素檢查，按《中國藥典》2005年版二部附錄的凝膠半定量檢測規定[3]進行。得到同樣的反應終點濃度結果，詳見表4。

表4 3批樣品半定量分析結果Tab 4 Results of semi-quantitative analysis for 3 batches of samples

由表4可見，陰性對照溶液結果為陰性，樣品陽性對照結果為陽性，系列溶液的反應終點濃度的幾何平均值均在規定的范圍之內，其符合試驗有效的條件成立，故本試驗結果有效。按照公式CE＝lg－1（∑X/2）計算內毒素濃度，得3批樣品內毒素含量分別為0.36 、0.36、0.255 EU·mL－1，均小于1.5 EU·mL－1。故半定量法可以反映出細菌內毒素的真正含量。

3 討論

適合鱟試劑反應水平的pH值范圍為6.8～8.0，藥物pH值過于偏酸或偏堿，超出了鱟試劑緩沖能力就可抑制或促進凝聚的形成[6]。本品的pH值范圍為4.80～5.20，對細菌內毒素檢查法存在干擾，經用2個廠家鱟試劑對樣品分別進行干擾試驗發現，當稀釋至6倍時，在鱟試劑靈敏度為0.25 EU·mL－1時均不對試驗產生干擾作用。通過試驗結果證實了此干擾作用可通過稀釋樣品而消除。使用細菌內毒素半定量分析法，可以將供試品溶液中的細菌內毒素的量確定在某一小范圍之內。本試驗結果表明，選擇適當濃度的稀釋液按半定量法進行試驗，可以直觀地計算出其細菌內毒素近似含量。本品3批細菌內毒素含量均小于其限值1.5 EU·mL－1。

復方鉀鈣鎂液是我院非法定制劑，《中國藥典》尚無其內毒素檢查的標準，為此筆者通過試驗建立了復方鉀鈣鎂液內毒素檢查的方法，其細菌內毒素限值可定為每毫升復方鉀鈣鎂液中含內毒素的量應小于1.5 EU。

[1]Braimbridge MV，Chayen J，Bitensky L，et al.Cold cardioplegia or continuous coronary perfusion?[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1977，74（2）：900.

[2]Hearse DJ，Braimbridge MV，Jynge P.Protection of the ischemic myocardium：cardioplegia[M].New York：Raven Press，1981：341～352.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄85.

[4]國家食品藥品監督管理局藥品審評中心.藥品技術評價文集（第二輯）[M].第1版.北京：中國醫藥科技出版社，2008：196～200.

[5]黃清泉，夏振民.藥品細菌內毒素檢查的實驗設計[J].中國藥學雜志，1997，32（2）：72.

[6]周學琴，張 麗，王迎春.果糖二磷酸鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].中國藥房，2004，15（4）：242.