可注射美洛昔康溫敏凝膠的研制

陳敏燕，吳飛華，潘九英，金芝貴

（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科，上海市 200011）

溫敏性凝膠是一類溫度響應型的智能凝膠材料，可以感知溫度的變化而產生功能性的效應。溫敏性凝膠材料由于具備原位凝膠的特性，被應用于藥物傳遞[1]、組織工程、細胞生物學等領域。

美洛昔康通過選擇性地抑制環氧合酶-2（COX-2）而阻止具有致炎作用的前列腺素等的合成，具有消炎、解熱和鎮痛的作用。臨床主要用于類風濕性關節炎、疼痛性骨關節炎的治療[2]，但腹痛和消化不良是其最常見的不良反應[3]。為了減輕美洛昔康帶來的胃腸道刺激性，并減少給藥次數和獲得穩定的血藥濃度，筆者以殼聚糖-甘油-硼砂為載體，研制了具有緩釋性能的可注射美洛昔康溫敏凝膠，用于關節腔注射給藥，使其在作用部位直接且平穩地發揮藥效，本文對該制劑的制備方法等介紹如下。

1 儀器與試藥

TV1800紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；SYC智能恒溫超級水槽（鞏義市英谷予華儀器廠）；pHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）；電子天平（上海天平儀器廠）。

殼聚糖（南通雙林生物制品有限公司，Mr：95000，脫乙酰度：91.3%）；甘油（浙江遂昌甘油廠）；硼砂（自貢鴻鶴制藥有限責任公司）；美洛昔康（南京長澳制藥有限公司，批號：071208，含量：99%）；美洛昔康溫敏凝膠（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，批號：080604、080610、080620，美洛昔康含量：0.035%）；其余試劑均為分析純。

2 制備

2.1 空白凝膠的制備

殼聚糖用1%的醋酸溶解，制備成2%的溶液。加入一定量的甘油后，在攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，充分攪拌均勻使所得溶液的pH值為7.0。將該混合溶液放入37℃的恒溫水浴中保持20 min，使體系膠凝充分，得到殼聚糖-甘油-硼砂水凝膠，該空白凝膠在室溫下為可流動的液態，放置于37℃恒溫水浴并保持20 min，得到均一的半固體狀態，倒置裝凝膠的西林瓶，凝膠不流動。室溫及37℃條件下空白凝膠的形態詳見圖1。

圖1 空白凝膠在不同條件下的形態A.室溫；B.37 ℃Fig 1 Morphology of blank hydrogel at different conditionsA.at room temperature；B.at 37℃

2.2 美洛昔康溫敏凝膠的制備

殼聚糖以1%的醋酸溶解，制備成2%的溶液。加入一定量甘油和美洛昔康藥物溶液，室溫攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，使所得溶液的pH值為7.0，充分攪拌使其混合均勻，放入37℃恒溫水浴中使其膠凝完全。

3 影響因素考察

3.1 溫度

按“2.1”項下方法制備殼聚糖-甘油-硼砂水凝膠，取未凝前樣品5份，每份2 mL，分別加入5個長10 cm、直徑1.4 cm的玻璃試管中，將試管分別放至于30℃、32℃、35℃、37℃、40℃的恒溫水浴中，每半分鐘取出觀察凝膠形成情況，以試管倒置30 s內凝膠不流動為凝膠形成的標志[4]，重復試驗3次，記錄凝膠形成平均所需的時間。溫度對凝膠形成的影響詳見表1。

表1 溫度對凝膠形成的影響Tab 1 Effect of temperature on formation of gel

表1結果表明，當環境溫度低于32℃時，凝膠不能形成，呈溶液狀；當環境溫度高于32℃時，凝膠形成，呈半固體狀，并且溫度越高，膠凝時間越短；當環境溫度為37℃時，凝膠從液態變成半固態只需3 min，表明本凝膠注射進入體內后能迅速膠凝，避免隨體液流失。

3.2 pH值

取殼聚糖2%溶液，加入甘油制備7份。每一份在攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，分別調節凝膠體系pH值至6.2、6.5、6.7、6.9、7.0、7.1、7.2，充分攪拌使其混合均勻。觀察凝膠形成情況以及膠凝時間，重復試驗3次，記錄凝膠形成平均所需的時間。pH值對凝膠形成的影響詳見表2。

表2 pH值對凝膠形成的影響Tab 2 Effect of pH on formation of gel

表2結果表明，本凝膠在近中性的環境中形成（pH值范圍為6.7～7.1）。pH值低于6.7的體系，凝膠不能形成，呈溶液狀。pH值高于7.1的體系，隨著硼砂的繼續加入，凝膠體系即刻成沉淀。在pH 6.7～7.1范圍內，隨著體系pH的升高，膠凝所需時間越短。pH 6.7和pH 6.9的凝膠體系膠凝所需時間較長。pH 7.1的凝膠體系濁度較高，偶見絲狀沉淀物，故本研究采用pH 7.0的凝膠體系。

3.3 甘油與殼聚糖比例

取殼聚糖2%溶液5份，每份分別加入不同量的甘油，使甘油與殼聚糖的比例分別為1∶10、1∶5、3∶10、2∶5、1∶2。并在攪拌條件下逐滴加入硼砂溶液，分別調節凝膠體系pH至7.0，充分攪拌使其混合均勻。觀察凝膠形成情況以及膠凝時間，重復試驗3次，記錄凝膠形成平均所需時間。甘油比例對凝膠形成的影響詳見表3。

表3 甘油與殼聚糖比例對凝膠形成的影響Tab 3 Effect of the ratio of glycerin to chitosan on formation of gel

表3結果表明，隨著甘油比例的增加，調節凝膠體系至固定pH值所需要硼砂溶液的量就越多，凝膠體系中含水量越多，形成凝膠所需要的時間越長。甘油-殼聚糖比例在1∶10和1∶5時，凝膠形成的時間很短，但是未凝前體系太黏稠，不適于注射給藥。甘油-殼聚糖比例在3∶10時，膠凝需時3 min，并且未凝前樣品稠度適中，比較適合注射給藥。甘油-殼聚糖比例在2∶5和1∶2時，凝膠形成所需的時間較長。

4 殼聚糖-甘油-硼砂溫敏凝膠中美洛昔康體外釋放度的考察

4.1 紫外分析方法的建立

4.1.1 測定波長的選擇。稱取10 mg的美洛昔康溶于100 mL的0.1 mol·L－1的NaOH中，經稀釋制得10 mg·L－1的美洛昔康對照溶液，以0.1 mol·L－1的NaOH為空白對照，在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，結果美洛昔康在364 nm波長處有最大吸收單峰，故確定364 nm為美洛昔康紫外檢測波長。

4.1.2 標準曲線的制備。制備20.05 mg·L－1的美洛昔康母液，分別取1.0、2.0、3.5、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL的容量瓶中，定容，于364 nm波長處測定吸光度，以美洛昔康的吸光度（A）對濃度（C）作線性回歸，得回歸方程C＝17.052A+0.2387（r＝0.9994）。結果表明，美洛昔康檢測濃度線性范圍為2.005～12.030 mg·L－1。

4.1.3 精密度試驗。精密吸取美洛昔康同一濃度對照溶液（10 mg·L－1）于364 nm波長處測定吸光度，重復進樣5次。結果，峰面積均值RSD＝0.25%，表明儀器精密度良好。

4.1.4 回收率試驗。精密吸取美洛昔康高、中、低3個濃度各2份的對照溶液，加入到按“2.1”項下方法制備的空白凝膠中，再加入0.1 mol·L－1的NaOH，攪拌使溶解，過濾，取續濾液用0.1 mol·L－1的NaOH定容，測定吸光度。結果，平均回收率為98.03%，RSD＝0.65%（n＝6）。

4.1.5 樣品含量測定。精密稱取3批美洛昔康溫敏凝膠樣品各2 g，按“4.1.4”項下的方法測定美洛昔康的含量。結果，3批樣品中美洛昔康的標示含量分別為97.35%、96.89%、97.90%（n＝3），平均標示含量為97.38%。

4.2 體外釋放度的測定

按“2.2”項下方法制備美洛昔康溫敏凝膠未凝前的樣品10 g（批號：080604、080610、080620），分別放入3個50 mL的圓底離心管中，于37℃恒溫水浴中放置20 min使該體系膠凝充分，膠凝后在凝膠上部加15 mL、pH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）作為釋放介質（達到漏槽條件）。將裝凝膠的離心管放入37 ℃、100 r·min－1的恒溫搖床中，分別于1、3、5、7、10、24、48、96、144、192、240、288 h取5 mL釋放樣品，同時補加5 mL同溫空白釋放介質。用紫外分光光度法分析釋放樣品，計算其累積體外釋放百分率。3批樣品的體外釋放曲線詳見圖2。

圖2 3批樣品體外釋放曲線Fig 2 Release curves of 3 batches of samples in vitro

圖2結果表明，3批樣品48 h時平均累積釋放百分率達56%，288 h時達76%。在288 h時取出凝膠樣品，凝膠依然呈半固體狀。

對3批樣品的體外釋放行為進行相似因子（f2）法[5]比較，f2的計算公式如下：

當f2值在50～100之間時，認為2種制劑的體外釋藥行為無顯著性差異。在該公式中，Rt和Tt表示2個批號的制劑在t時間點的平均累積釋放百分率，n為測試點數。批號080604和080610的f2值為58.4，批號080604和080620的f2值為51.4，批號080610和080620的f2值為69.4，表明3個批號的樣品體外釋藥行為無顯著性差異。

5 討論

在288 h時取出凝膠樣品觀察，發現凝膠依然呈半固體狀，與0 h相比，凝膠骨架結構更緊致了，具有一定的機械強度，這可能是后半段時間美洛昔康從凝膠中釋放速度減慢的一個重要原因。

殼聚糖-甘油-硼砂溫敏凝膠制備條件溫和，符合環保要求。作為一種藥物載體骨架系統，能夠在一定程度上控制藥物的被動擴散，即可作為注射植入性材料，也可用于腔道非注射性涂抹，是一種可注射的緩控釋藥物給藥系統。本凝膠溫度敏感性高，機械強度好，有望用于藥物載體、生物組織工程等領域，具有廣泛的應用前景。

本研究制備的美洛昔康溫敏凝膠是可供關節腔注射的、具備緩釋性能的新型藥物制劑，為美洛昔康治療風濕性關節炎、疼痛性骨關節炎提供了一種新的給藥方式。

[1]Ruel-Gariepy E，Leroux JC.In situ-forming hydrogelsreview of temperature-sensitive systems[J].Eur J Pharm Biopharm，2004，58（2）：409.

[2]陳新謙，金有豫，湯 光主編.新編藥物學[M].第15版.北京：人民衛生出版社，2004：195.

[3]王慶利，盛春元，趙桂宏.新型非甾體抗炎藥COX-2選擇性抑制劑的研究及應用進展[J].中國藥房，2001，12（5）：305.

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[5]Jeffrey W，Henry H.Mathematical comparison of dissolution profiles[J].Pharm Tech，1996，20（6）：64.