分光光度法測(cè)定栽培川貝母中總生物堿的含量Δ

余江平，劉震東，王曙#

（1.四川綿陽(yáng)市中心醫(yī)院，綿陽(yáng)市 621000；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都市 610041）

目前，《中國(guó)藥典》收載作川貝母來(lái)源種植物的資源日漸瀕危，商品遠(yuǎn)不能滿足國(guó)內(nèi)、外市場(chǎng)的需要。適應(yīng)現(xiàn)代中藥材生產(chǎn)發(fā)展的趨勢(shì)，實(shí)施規(guī)范化栽培（GAP）是解決川貝母資源問(wèn)題的主要途徑。為了科學(xué)評(píng)價(jià)栽培川貝母的生藥品質(zhì)，需要對(duì)其有效成分的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。生物堿類是該藥材主要有效成分類別之一，是貝母類藥材及成藥的常用檢測(cè)指標(biāo)。因此，筆者采用分光光度法對(duì)栽培川貝母中總生物堿含量進(jìn)行測(cè)定，以為制訂栽培川貝母的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；BP211P型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

溴甲酚綠（分析純，上海試劑三廠）；氯仿、甲醇、濃氨試液、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等試劑均為市售分析純，水為蒸餾水；西貝堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0767-9403）；栽培濃蜜貝母Fritillaria mellea S.Y.Tang et S.C.Yueh和瓦布貝母F.wabuensis S.Y.Tang et S.C.Yueh均采自四川茂縣松坪溝川貝母規(guī)范化種植基地，由筆者鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取于105℃干燥至恒重的西貝堿對(duì)照品5.0 mg，置10 mL量瓶中，加氯仿7 mL，置水浴上微熱使溶解，放至室溫，加氯仿至刻度，搖勻。精密吸取2 mL，置10 mL量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，即得（每1 mL含西貝堿0.1 mg）。

2.2 供試品溶液的制備

取于60℃干燥6 h后的藥材粉末1 g，置圓底燒瓶中，加濃氨溶液1.5 mL，浸潤(rùn)1 h，加氯仿-甲醇（4∶1）混合溶劑40 mL，65～70℃水浴回流提取4 h，提取液放冷后濾過(guò)于50 mL量瓶中，用適量混合溶劑洗滌藥渣，濾過(guò)，濾液合并，加混合溶劑至刻度，搖勻，即得。

2.3 溴甲酚綠緩沖液的制備

精密稱取溴甲酚綠0.050 g，加入6 mL 0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液，再加入1.012 g磷酸二氫鉀和適量水使溶解，用水稀釋至100 mL，搖勻，用0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液數(shù)滴調(diào)pH值至4.4，濾過(guò)，收集續(xù)濾液，即得。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密吸取對(duì)照品溶液1 mL、供試品溶液2 mL，分別置50 mL具塞錐形瓶中，減壓回收溶劑，加入氯仿至10 mL；另取10 mL氯仿，置另一50 mL具塞錐形瓶中，制備空白液。各加蒸餾水5.0 mL，加pH 4.4的0.05%溴甲酚綠緩沖液2.0 mL，密塞，劇烈振搖3 min后移入60 mL分液漏斗中，靜置20～30 min。分取氯仿層，以干燥濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液置比色皿中，在200～760 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，2種溶液在416 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，故選擇416 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0、0.5、0.8、1.0、1.3、1.6 mL，分別置50 mL具塞錐形瓶中，自“加入氯仿至10 mL”起，至“取續(xù)濾液至比色皿中”，同“2.4”項(xiàng)下方法操作。照紫外分光光度法（2005年版《中國(guó)藥典》（一部）附錄ⅤB），在416 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.05919X－0.005333（r＝0.9996）。結(jié)果表明，西貝堿的檢測(cè)濃度在4.5～14.5 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液1.0 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，照“2.5”項(xiàng)下方法，自“加入氯仿至10 mL”起，依法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果，RSD＝1.9%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在室溫下每隔15 min測(cè)定一次吸光度。結(jié)果，RSD＝1.5%，表明供試品溶液在80 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知總生物堿含量的濃蜜貝母（批號(hào)：030802，總生物堿含量：0.202%）5份，精密稱定；取西貝堿對(duì)照品10.10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度（1.01 mg·mL-1），精密吸取1.2、1.0、0.8 mL加入樣品中，按“2.2”和“2.5”項(xiàng)下方法制樣并測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為98.76%，RSD＝2.5%（n＝5）。

2.9 栽培川貝母總生物堿的含量測(cè)定

取該基地連續(xù)2年生產(chǎn)的共12批栽培川貝母藥材（濃蜜貝母和瓦布貝母各6批），分別按“2.2”項(xiàng)下方法制樣。根據(jù)藥材中生物堿含量，精密吸取2～4 mL，各加氯仿至10 mL，照“2.5”項(xiàng)下方法，自“加入氯仿至10 mL”起，依法測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中西貝堿的質(zhì)量（μg），計(jì)算總生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 1 Content determination of samples

3 討論

川貝母中總生物堿的含量測(cè)定方法有多種[1～3]，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)非水滴定法操作復(fù)雜、耗時(shí)、難度大，可操作性差；酸堿滴定法易受到共存干擾物質(zhì)的影響，且無(wú)法滴定堿性較弱的生物堿；兩相滴定法終點(diǎn)觀察困難，易帶來(lái)誤差；酸性染料比色法是目前測(cè)定貝母類總生物堿最為常用、可靠的方法[4]。因此，選擇酸性染料比色法作為定量分析方法。酸性染料比色法常用的染料有2種：溴麝香草酚藍(lán)和溴甲酚綠。由于采用溴麝香草酚藍(lán)作為酸性染料時(shí)空白吸收較高且不穩(wěn)定，故本試驗(yàn)選用溴甲酚綠作為酸性染料，并嚴(yán)格控制影響試驗(yàn)結(jié)果的操作條件，通過(guò)以西貝堿為對(duì)照來(lái)對(duì)栽培川貝母的總生物堿進(jìn)行含量測(cè)定[1]。結(jié)果表明，本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于栽培川貝母的質(zhì)量控制。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，以下幾方面會(huì)影響本法測(cè)量的準(zhǔn)確度，需要特別注意：（1）水浴回流提取時(shí)水浴溫度不能過(guò)高。如果溫度過(guò)高，劇烈沸騰，可使大量粉末沖出溶液，附于無(wú)溶劑的燒瓶壁上，使生物堿不能充分提取，致使含量測(cè)定結(jié)果偏低。（2）加入溴甲酚綠染色，應(yīng)劇烈振搖達(dá)3 min，以使反應(yīng)完全。（3）振搖后應(yīng)靜置20～30 min，并將氯仿層用干燥濾紙濾過(guò)，以除去氯仿層可能含有的水及染料。

[1]王沖之，孫 健，李 萍.貝母類藥材生物堿及生物堿苷含量測(cè)定方法學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（6）：416.

[2]高 錦，王 錦，劉一群，等.氣管炎丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19（2）：101.

[3]王 偉，譚曉梅.荷葉總生物堿含量測(cè)定方法的研究[J].中藥材，2004，27（1）：50.

[4]劉喜綱，劉翠哲，常金花.應(yīng)用酸性染料比色法測(cè)定總生物堿的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（11）：875.