川芎化學成分分離鑒定與藁本內酯的含量測定Δ

張 玲，劉友平，李旻，李惠勇，范婧嫻

（成都中醫藥大學，成都市 611137）

川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）為常用中藥，始載于《神農本草經》，味辛、微苦，性溫，有活血化瘀、理氣止痛等功效，常用于頭痛及瘀血證的治療。其化學成分研究國內、外報道較多，主要有揮發油、生物堿、酚（酸）性成分等[1～3]。藁本內酯作為川芎中主要有效成分，現代化學和藥理研究表明，具有抗血小板聚集、松弛子宮和氣管平滑肌、抑制中樞神經系統等活性[4，5]，在川芎中可達1%以上[6]，在川芎揮發油中達30%以上[7]。因此，藁本內酯可作為川芎藥材質量評價的指標成分之一。筆者建立了川芎中藁本內酯分離方法，并建立了其含量測定方法以用于川芎藥材的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

SGW-4型顯微熔點測定儀（上海精密科學儀器有限公司）；Bruker Avance 600型核磁共振（NMR）儀（瑞士Bruker公司）；Nicolet FTMS-2000型質譜（MS）儀（美國Nicolet公司）；LC-10A型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；CLASS-VP工作站（日本島津公司）；SPD-10A型紫外檢測器（日本島津公司）；ΜV-Vis 8500型紫外-可見分光光度（UV）計（無錫科達公司）；BP211D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；BUG25-12型超聲波清洗機（25 kHz，500 W，上海必能信超聲波有限公司）；R-201型旋轉蒸發儀（上海申勝生物技術有限公司）。

1.2 試藥

柱色譜硅膠（100～200目、300～400目，青島海洋化工廠）；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；其它試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）；10份川芎藥材樣品分別收集于四川都江堰徐渡鄉川芎中藥材生產質量管理規范（GAP）基地及西南藥都市場，經成都中醫藥大學中藥鑒定教研室陳新副教授鑒定均為川芎L.chuanxiong Hort.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

川芎粗粉1.5 kg經乙醇滲漉提取得提取物120 g；提取物50 g經硅膠柱色譜，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（9∶1，8∶2）梯度洗脫和石油醚（30～60℃）-乙醚（9∶1）洗脫得化合物1（150 mg）、2（15 mg）和3（88 mg），結構式見圖1。

圖1 化合物1～3的結構式A.化合物1；B.化合物2；C.化合物3Fig 1 Structural formula of compounds 1～3A.compound 1；B.compound 2；C.compound 3

2.2 結構鑒定

2.2.1 化合物1 淺黃色油狀物，略有酯香味；UV λmax nm：207、283、320；（電子轟擊離子源（EI）-MS）：m/z 190（M+），161（基峰），148，133，120，106，78，55。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：0.96（3H，t，J＝0.75，H-11），1.50（2H，m，H-10），2.38（2H，q，J＝7.5，H-9），2.46（2H，m，H-5），2.60（2H，t，J＝9.6，H-4）），5.23（1H，t，J＝7.8，H-8），6.01（1H，m，H-6），6.28（1H，d，J＝9.6，H-7），以上光譜數據與文獻[8，9]報道的Z-藁本內酯（Z-ligustilide）相符。

2.2.2 化合物2 白色片狀結晶（石油醚-乙酸乙酯），mp：134～136 ℃，NMR光譜數據見表1，與文獻[2，10]報道的Z-6，8′，7，3′-二聚藁本內酯（Z-6，8′，7，3′-diligustilide）相符。

2.2.3 化合物3 白色粉末，mp：124～126℃，NMR光譜數據見表1，與文獻[2，10]報道的Z，Z′-6，6′7，3′a-二聚藁本內酯（Z，Z′-6，6′7，3′a-diligustilide）相符。

表1 化合物2、3的1H（600 MHz）、13C-NMR（600 MHz）數據（CDCl3）Tab 1 The1H（600 MHz）and13C-NMR（600 MHz）data of compounds 2 and 3（CDCl3）

2.3 川芎藥材中藁本內酯的HPLC含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：HypersiL ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：320 nm。在此色譜條件下，川芎藥材中藁本內酯與其它組分能達到基線分離。色譜見圖2。

2.3.2 標準品溶液的制備 取藁本內酯標準品約60 mg，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（2.42 mg·mL-1），精密量取1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過3號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密閉，稱重，超聲提取45 min，取出，稱重，加甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖2 高效液相色譜圖A.標準品；B.供試品；a.Z-藁本內酯Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.teat sample；a.Z-ligustilide

2.3.4 線性關系考察 分別精密吸取藁本內酯標準品貯備液0.2、0.5、1、1.5、2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取上述不同濃度的標準品溶液各10μL，分別進樣測定。以藁本內酯進樣量（X，μg）對峰面積積分值（A）進行線性回歸，得標準曲線方程A＝2167715X+116629（r＝0.9998）。結果表明，藁本內酯進樣量在0.484～4.84 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗 取標準品溶液，依選定的色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果，RSD＝0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好，

2.3.6 穩定性試驗 分別取標準品溶液和供試品溶液于棕色瓶中，密閉、室溫貯藏，于0、2、6、12、24 h 進樣2次，測定藁本內酯的峰面積。結果，RSD分別為0.38%、0.86%（n＝5），表明藁本內酯在該溶液中穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一樣品粉末6份，照“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，進樣測定，計算藁本內酯的含量。結果，RSD＝1.89%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知藁本內酯含量的川芎藥材粉末約0.25 g，6份，精密稱定，分別精密加入藁本內酯標準品溶液5 mL和甲醇10 mL，按“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，分別測定藁本內酯的含量。結果，平均回收率為96.27%，RSD＝2.3%（n＝6）。

2.3.9 樣品含量測定 取川芎樣品，按“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，各進樣10 μL，測定2次，根據回歸方程計算樣品中藁本內酯的含量，結果見表2。

表2 不同批次川芎藥材中藁本內酯的質量分數Tab 2 Mass ratio of ligustilide in different batches of L.chuanxiong

3 討論

由于川芎中揮發油類成分在室溫條件下不穩定，易發生脫氫、氧化等反應，故本試驗采用乙醇滲漉、低沸程溶劑洗脫分離，條件溫和，經濟高效，能使川芎中揮發性成分不被破壞，得到較好的分離。

藁本內酯在川芎藥材中含量較高，藥理作用明確，但因其在室溫條件下穩定性較差，是否能作為川芎含量測定指標成分尚存在爭議。本試驗以分離自制的藁本內酯為標準品，建立了HPLC含量測定方法，對所收集的10批次藥材進行了含量測定，按藥材中所含水分10%計，暫定標準為：川芎藥材中藁本內酯含量以干燥品計不低于7.0%。

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