重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)缺血后處理大鼠心臟功能的保護(hù)作用

趙倩，秦儉，鄭維平，邱清艷

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶市 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，重慶市 400016）

2003年Zhao等[1]在狗缺血/再灌注研究中發(fā)現(xiàn)在心肌較長時(shí)間缺血后開始再灌注前對(duì)心臟進(jìn)行3個(gè)短周期再灌、停灌處理（即30 s再灌-30 s再阻斷），即進(jìn)行缺血后處理（IPC），具有明顯對(duì)抗心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與IPC激活再灌注損傷補(bǔ)救酶（Reperfusion injury salvage kinase，RISK）中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、ERK信號(hào)通路有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，重組促紅細(xì)胞生成素[2]和蛋白激酶C-腺苷A2b受體激活劑[3]等多種藥物亦具有類似IPC效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）模型，應(yīng)用PI3K/Akt特異抑制劑Wortmannin，探討PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）對(duì)IPC大鼠心臟功能的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 試藥

重組人紅細(xì)胞生成素注射液（商品名：益比奧，以下簡稱rhEPO，沈陽三生制藥有限公司，批號(hào)：20090207V，規(guī)格：10000 IU·1.0 mL－1）；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)：F20030816，進(jìn)口分裝，含量：≥95%）；Wortmannin（以色列Fermentek公司，批號(hào)：W022，純度：≥99%）。

1.2 儀器

DHG-30動(dòng)物人工呼吸機(jī)（浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠）；BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（泰盟科技公司）；心電圖機(jī)（上海醫(yī)療儀器四廠）。

1.3 動(dòng)物

♂Sprague-Dawley（SD）大鼠42只，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（渝2007-0001）），體質(zhì)量200～300 g。

2 方法

2.1 I/R模型制作

將大鼠以3%戊巴比妥鈉（25 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠臺(tái)上，以針狀電極插入右前肢和左后肢皮下，連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行人工通氣（潮氣量8～10 mL，呼吸頻率60～70次·min－1）；分離右頸總動(dòng)脈插入硅膠管，導(dǎo)管另一端通過壓力傳感器連接BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，然后緩慢插入導(dǎo)管至左心室，測(cè)定左室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左室內(nèi)壓最大下降速率（－dp/dtmax）；分離頸外靜脈并插入導(dǎo)管以備給藥。沿胸骨左緣旁0.5 cm切開皮膚，剪斷第3、4、5根肋骨，進(jìn)入胸腔，打開心包暴露心臟，在左心耳根部下緣2 mm處進(jìn)針，用6/0無損傷縫合針穿過左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）下方的心肌表層，從肺動(dòng)脈圓錐左緣出針穿線[4]，待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定10 min后記錄正常參數(shù)，然后在縫線兩端穿過一塑料管形成血管松合器，結(jié)扎時(shí)用一細(xì)小硅膠墊于血管與結(jié)扎線之間，以造成左心室前壁缺血30 min，然后松開活結(jié)，恢復(fù)左冠狀動(dòng)脈血液灌注180 min。LAD結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)[5]：心電圖顯示ST段抬高、QRS波升高、增寬和缺血心肌顏色變?yōu)榍嘧仙AD再通成功標(biāo)準(zhǔn)：解開結(jié)扎線后QRS波振幅逐漸回落、抬高的ST段回落和缺血區(qū)心肌顏色恢復(fù)為紅色。

2.2 分組和給藥

大鼠隨機(jī)分為7組，每組6只，分別為假手術(shù)組（Sham組）、I/R組、IPC組、IPC+Wortmannin組（IPC+W組）、rhEPO組、rhEPO+Wortmannin組（rhEPO+W組）、rhEPO+IPC組。Sham組只穿線而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，觀察210 min，其余各組均于冠脈結(jié)扎后停灌30 min和復(fù)灌180 min（缺血/再灌注，I/R），I/R組只進(jìn)行I/R處理，IPC組在復(fù)灌180 min前給予3次10 s的再灌注/缺血（R/I）循環(huán)，IPC+W組在3次10 s的R/I循環(huán)前5 min經(jīng)頸外靜脈注射 Wortmannin 15 μg·kg－1[2]，rhEPO組在復(fù)灌180 min前經(jīng)腹腔注射rhEPO（5000 IU·kg－1）[2]，rhEPO+W組在復(fù)灌180 min前先后給予Wortmannin（15 μg·kg－1）和rhEPO（5000 IU·kg－1），rhEPO+IPC組在復(fù)灌180 min前給予3次10 s R/I循環(huán)，并腹腔注射rhEPO（5000 IU·kg－1）。

2.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

血流動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測(cè)：分別測(cè)定結(jié)扎前基礎(chǔ)狀態(tài)下（Baseline）、缺血后30 min（I 30 min）、再灌注后30 min（R 30 min）、再灌注后180 min（R 180 min）的心功能參數(shù)：LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

各組大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax變化詳見表1、表2、表3、表4。

表1 各組大鼠LVSP變化（±s，n＝6）Tab 1 The change of LVSPin each group（±s，n＝6）

表1 各組大鼠LVSP變化（±s，n＝6）Tab 1 The change of LVSPin each group（±s，n＝6）

與Sham組比較：＊P＜0.05；與I/R組比較：▲P＜0.05；與IPC組比較：#P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05compared with Sham group：＊P＜0.05；compared with I/R group：▲P＜0.05；compared with IPC group：#P＜0.05；compared with rhEPO group：△P＜0.05

組別Sham組I/R組IPC組IPC+W組rhEPO組rhEPO+W組rhEPO+IPC組LVSP/mmHg R 180 min 136.91±7.6687.04±7.76＊128.80±7.41＊▲88.17±6.27＊#128.74±6.69＊▲85.57±7.45＊△131.64±7.28＊▲Baseline 137.15±7.49136.27±6.94137.64±6.67136.66±8.01137.33±7.16136.52±7.36136.69±8.10 I 30 min 136.17±7.47114.39±7.08＊110.54±6.51＊113.18±5.83＊112.64±5.87＊114.30±6.53＊111.55±7.13＊R 30 min 138.48±6.6795.94±7.34＊120.47±6.69＊▲91.94±6.56＊#111.55±7.13＊▲92.01±6.62＊△121.56±6.39＊▲

表2 各組大鼠LVEDP變化（±s，n＝6）Tab 2 The change of LVEDPin each group（±s，n＝6）

表2 各組大鼠LVEDP變化（±s，n＝6）Tab 2 The change of LVEDPin each group（±s，n＝6）

與Sham組比較：＊P＜0.05；與I/R組比較：▲P＜0.05；與IPC組比較：#P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05compared with Sham group：＊P＜0.05；compared with I/R group：▲P＜0.05；compared with IPC group：#P＜0.05；compared with rhEPO group：△P＜0.05

組別Sham組I/R組IPC組IPC+W組rhEPO組rhEPO+W組rhEPO+IPC組LVEDP/mmHg R 180 min 8.57±1.1028.27±0.70＊15.44±0.92＊▲28.28±0.88＊#15.42±1.03＊▲28.39±0.87＊△15.25±0.79＊▲Baseline 8.40±1.038.27±0.888.18±0.648.39±0.898.27±0.888.44±0.898.21±0.81 I 30 min 8.56±0.9221.37±1.08＊21.33±0.95＊21.36±1.19＊22.25±0.78＊21.36±1.05＊21.58±1.10＊R 30 min 8.63±1.0125.30±0.78＊18.35±0.77＊▲25.35±0.86＊#18.46±0.73＊▲25.15±0.91＊△18.23±0.67＊▲

表3 各組大鼠+dp/dtmax變化（±s，n＝6）Tab 3 The change of+dp/dtmax in each group（±s，n＝6）

表3 各組大鼠+dp/dtmax變化（±s，n＝6）Tab 3 The change of+dp/dtmax in each group（±s，n＝6）

與Sham組比較：＊P＜0.05；與I/R組比較：▲P＜0.05；與IPC組比較：#P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05compared with Sham group：＊P＜0.05；compared with I/R group：▲P＜0.05；compared with IPC group：#P＜0.05；compared with rhEPO group：△P＜0.05

組別Sham組I/R組IPC組IPC+W組rhEPO組rhEPO+W組rhEPO+IPC組+dp/dtmax/mmHg·s-1 R 180 min 5777.1±208.762637.0±211.30＊4536.7±206.75＊▲2588.8±193.96＊#4573.2±198.74＊▲2605.2±191.67＊△4687.2±202.91＊▲Baseline 5839.0±185.105875.2±191.305853.5±190.085777.1±180.215819.5±200.105789.4±208.015843.4±206.56 I 30 min 5811.0±202.423151.5±199.11＊3128.6±194.32＊3053.6±190.91＊3146.6±193.39＊3102.6±200.96＊3166.6±211.06＊R 30 min 5801.6±191.632792.0±215.47＊3541.7±183.33＊▲2842.9±181.40＊#3520.4±198.53＊▲2809.1±187.88＊△3553.3±213.36＊▲

表4 各組大鼠－dp/dtmax變化（s，n＝6）Tab 4 The change of－dp/dtmax in each group（±s，n＝6）

表4 各組大鼠－dp/dtmax變化（s，n＝6）Tab 4 The change of－dp/dtmax in each group（±s，n＝6）

與Sham組比較：＊P＜0.05；與I/R組比較：▲P＜0.05；與IPC組比較：#P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05compared with Sham group：＊P＜0.05；compared with I/R group：▲P＜0.05；compared with IPC group：#P＜0.05；compared with rhEPO group：△P＜0.05

組別Sham組I/R組IPC組IPC+W組rhEPO組rhEPO+W組rhEPO+IPC組-dp/dtmax/mmHg·s-1 R 180 min 4482.3±209.652530.4±192.43＊3634.5±213.31＊▲2532.8±193.13＊#3696.8±198.31＊▲2563.1±203.40＊△3719.6±197.22＊▲Baseline 4559.8±206.974581.9±193.474565.0±194.524587.0±204.934585.2±207.844552.2±196.004574.6±185.06 I 30 min 4579.5±189.433053.8±193.18＊3101.9±202.87＊3012.4±212.12＊3089.7±205.10＊3060.1±187.09＊3011.6±204.22＊R 30 min 4548.2±190.492844.0±195.92＊3380.6±192.89＊▲2838.5±193.56＊#3366.7±205.07＊▲2854.2±199.97＊△3389.5±200.81＊▲

由表1、2、3、4可見，在基礎(chǔ)狀態(tài)下各組之間LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和－dp/dtmax無顯著性差異；I/R組在各不同時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較，LVSP均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I 30 min時(shí)，與Sham組比較，各組LVSP均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I/R組比較，IPC組、rhEPO組和rhEPO+IPC組R 30 min、R 180 min時(shí)LVSP明顯升高，IPC+W組與IPC組比較、rhEPO+W組與rhEPO組比較前者均顯著降低；各組+dp/dtmax、－dp/dtmax變化與LVSP相似，而LVEDP變化與之相反：I 30min時(shí)，與Sham組比較，LVEDP均增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與I/R組比較，IPC組、rhEPO組和rhEPO+IPC組R 30 min、R 180 min時(shí)LVEDP明顯降低，IPC+W組與IPC組比較、rhEPO+W組與rhEPO組比較前者均顯著升高。

4 討論

I/R損傷是心血管常見的病理生理現(xiàn)象，隨著血運(yùn)重建術(shù)的開展，減輕再灌注損傷成為心血管病學(xué)的研究熱點(diǎn)。近年研究表明，IPC可通過減輕過氧化損傷、抑制鈣超載、激活再灌注損傷補(bǔ)救酶途徑、抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放等機(jī)制而具有縮小心肌梗死面積、減輕心肌損傷、抗心律失常、改善心功能等心臟保護(hù)作用。作為一種強(qiáng)有力的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，IPC為I/R損傷的防治提供了新方法。但該方法可能存在血管壁損傷、斑塊脫落等問題。研究[3]發(fā)現(xiàn)PKC-腺苷A2b受體激活劑等藥物可產(chǎn)生和IPC相似的心臟保護(hù)效應(yīng)。rhEPO作為一種造血因子已廣泛應(yīng)用于臨床。近年大量基礎(chǔ)與臨床研究提示，rhEPO除經(jīng)典的造血效應(yīng)外，還有諸多非造血效應(yīng)，如對(duì)包括心腦在內(nèi)的多種組織器官具有保護(hù)作用[6]。rhEPO介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用可能涉及多條信號(hào)通路，如Jak2-STAT5途徑、PI3K/Akt途徑、Jak2-NF-KB途徑和Ras蛋白-有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，但無一得到最終肯定。

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠急性心肌I/R模型，以穿過縫線兩端的塑料管而制成血管松合器，通過控制其松弛狀態(tài)實(shí)現(xiàn)后處理的反復(fù)短暫I/R時(shí)間的準(zhǔn)確控制。結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組在不同時(shí)間點(diǎn)的LVSP、+dp/dtmax和－dp/dtmax均明顯降低，LVEDP明顯升高，證實(shí)了I/R可引起心肌收縮與舒張功能障礙。與I/R組比較，IPC組再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的LVSP、+dp/dtmax和－dp/dtmax均升高，LVEDP降低，表明IPC使心臟收縮及舒張功能改善。Wortmannin是PI3K通路的特異性抑制劑，本研究結(jié)果顯示，與IPC組相比，IPC+W組在再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與I/R組相當(dāng)，提示W(wǎng)ortmannin可明顯削弱IPC的心功能保護(hù)作用，與Tsang等[7]在大鼠離體心臟模型研究中觀察到的結(jié)果相似。提示應(yīng)用Wortmannin后，IPC的心肌保護(hù)效應(yīng)顯著削弱，因此PI3K通路的激活可能是IPC的保護(hù)機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在再灌注前5 min經(jīng)靜脈注射rhEPO，與I/R組相比，rhEPO組灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的LVSP、+dp/dtmax和－dp/dtmax升高，LVEDP下降，表明rhEPO能夠改善心臟收縮和舒張功能，起到與IPC類似的效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與rhEPO組相比，rhEPO+W組在再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與I/R組相當(dāng)，rhEPO的心功能保護(hù)作用明顯削弱，提示W(wǎng)ortmannin亦能削弱rhEPO誘導(dǎo)IPC的心臟功能保護(hù)效應(yīng)，因此PI3K通路的激活可能也是rhEPO發(fā)揮心臟功能保護(hù)作用的機(jī)制之一。而rhEPO+IPC組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)較IPC組和rhEPO組并無進(jìn)一步改善，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者聯(lián)合應(yīng)用并不能進(jìn)一步發(fā)揮心臟功能保護(hù)作用。

進(jìn)一步積極開展IPC及藥物后處理的基礎(chǔ)及臨床研究，確定具體實(shí)施時(shí)間、操作方法、作用機(jī)制、臨床安全性及有效性，對(duì)于防治缺血心肌的再灌注損傷具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

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