抑肽酶對腦缺血再灌注大鼠腦組織CD4+、CD8+T淋巴細胞表達的影響

江承平，王曉明，吳碧華，劉 福

（川北醫學院附屬醫院，南充市 637007）

近年來免疫炎癥反應在腦缺血再灌注損傷中所起的作用逐漸受到關注。腦缺血再灌注過程中，在黏附分子的介導下，循環中的白細胞和腦微血管內皮細胞黏附、積聚、浸潤于缺血區腦組織，釋放炎癥介質從而加重缺血神經元的損傷。CD4+、CD8+T淋巴細胞可反映機體免疫狀態的變化，抑肽酶是從牛肺中提取的一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有非特異性絲氨酸蛋白酶抑制活性，在體外循環大手術出血、胰腺炎、缺血再灌注損傷等方面有多種作用。自加拿大“BART”研究發表后，由于對臨床使用的抑肽酶商品安全性存在疑問，包括拜耳公司的特斯樂（Trasylol）在內的抑肽酶制劑相繼暫停美國、歐洲和中國市場（我國于2007年暫停使用）的銷售，但其生理病理作用值得進一步研究。本文擬研究大鼠腦損傷后不同時期損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤情況的變化，探討抑肽酶在細胞免疫應答的干預下，對腦缺血再灌注后繼發性腦損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試藥

抑肽酶（麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司，批號：081023，規格：100萬KIU·mL－1）；免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗鼠CD4+、CD8+單克隆抗體、即用型二氨基聯苯胺（DAB）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 儀器

動物頭顱立體定位儀（西安光學醫療器械公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動物及分組

健康♂SD大鼠105只，體質量280～320 g，由川北醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（川2008-18），所有大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組、抑肽酶組，每組35只。

1.4 模型制作

大鼠局灶性腦缺血再灌注模型參照Longa等[1]報道的方法，以大鼠清醒后左前肢不能完全伸展、爬行時向左側轉圈為模型成功標準。假手術組除尼龍線插入深度＜15 mm外，其余過程同模型組。抑肽酶組于缺血前24 h及再灌注即刻、24 h、48 h、72 h、4 d、5 d分別尾靜脈注射5萬KIU·100 g－1（體質量）抑肽酶（相當于臨床給藥劑量的10倍））；假手術組與模型組用同樣方法注射等體積生理鹽水。

1.5 標本采集及處理

分別于術后24 h、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d 7個時間點，隨機抽取5只大鼠進行灌注固定，并斷頸取腦，從視交叉吻合端至尾端冠狀連接做冰凍切片。

1.6 免疫組化檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤情況

檢測嚴格按照SP試劑盒說明書操作。每例均隨機觀察8個高倍視野，讀取陽性細胞數。

1.7 統計學分析

統計軟件為SPSS13.0，計量資料的均數以均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行多個樣本均數比較，組間均數兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 HE染色觀察

假手術組腦組織結構完整，未見有缺血變性改變。模型組和抑肽酶組缺血梗死灶主要位于額、頂葉皮質和紋狀體尾殼核，HE染色下表現為組織結構紊亂，神經纖維網呈空泡樣改變，變性、水腫明顯，神經細胞數量減少，染色淡，核固縮、溶解等，說明大腦中動脈閉塞法制作模型成功。

2.2 免疫組化結果

缺血再灌注損傷后各時間點各組CD4+、CD8+T淋巴細胞計數詳見表1、表2。

表1 缺血再灌注損傷后各時間點各組CD4+T淋巴細胞計數（±s，n＝5）Tab 1 CD4+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

表1 缺血再灌注損傷后各時間點各組CD4+T淋巴細胞計數（±s，n＝5）Tab 1 CD4+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

與假手術組比較：#P＜0.05；與模型組比較：＊P＜0.05vs.sham operation group：#P＜0.05；vs.model group：＊P＜0.05

組別假手術組模型組抑肽酶組時間24 h 21.11±11.0267.34±20.43#44.09±16.22＊4 d 20.16±9.3682.61±13.14#57.69±10.43＊6 d 19.98±12.2090.15±7.86#70.00±12.62＊8 d 20.19±11.19120.11±10.32#103.11±10.27＊10 d 19.92±9.08143.52±12.03#97.33±10.11＊12 d 21.02±10.00131.22±7.45#95.33±9.03＊14 d 20.09±10.08111.89±12.52#80.43±10.40＊

表2 缺血再灌注損傷后各時間點各組CD8+T淋巴細胞計數（±s，n＝5）Tab 2 CD8+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

表2 缺血再灌注損傷后各時間點各組CD8+T淋巴細胞計數（±s，n＝5）Tab 2 CD8+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

與假手術組比較：#P＜0.05；與模型組比較：＊P＜0.05vs.sham operation group：#P＜0.05；vs.model group：＊P＜0.05

組別假手術組模型組抑肽酶組時間14 d 15.41±8.02100.54±3.73#75.69±5.41＊24 h 15.36±7.6843.72±8.31#30.00±5.33＊4 d 16.42±8.5256.15±5.04#42.07±8.90＊6 d 15.88±8.5275.31±6.80#59.78±8.54＊8 d 14.98±7.8995.44±7.00#98.31±6.81＊10 d 15.78±7.56120.38±4.50#88.31±3.12＊12 d 16.02±6.89113.67±3.89#81.00±8.93＊

由表1、表2可見，模型組大鼠缺血再灌注損傷后24 h損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細胞計數即有明顯升高，且逐漸上升，至傷后10 d達最大值。抑肽酶組大鼠缺血再灌注損傷后24 h損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細胞計數也有升高，但低于模型組（P＜0.05），且傷后8 d達高峰，其余各時間點CD4+、CD8+T淋巴細胞計數均低于模型組（P＜0.05）。假手術組CD4+、CD8+T淋巴細胞數則無明顯增加。

3 討論

腦缺血一定時間恢復血液供應后，會出現嚴重的腦機能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷，其與自由基的生成、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有關。不同類型的腦組織損傷中，免疫反應參與繼發性損傷的發病過程[2]，且多數研究[3，4]認為免疫反應加重了繼發性腦損傷。另有研究[5]表明顱腦損傷后不同時期血液中髓鞘堿性蛋白抗體效價與腦橋脫髓鞘病變的程度之間呈密切的正相關關系，說明體液免疫應答可能參與繼發性腦損傷的病理過程[5]。李衛等[6]發現，患者腦脊液中的IgG含量與早期的Lasgow評分及恢復期的殘疾評分密切相關，亦提示體液免疫反應加重繼發性腦損傷。CD4+、CD8+T淋巴細胞與神經元凋亡呈密切的相關性[7]，通過介導靶細胞凋亡加重腦組織繼發性損傷，且與顱腦損傷后期腦萎縮密切相關。

抑肽酶是一種非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，以往被廣泛應用于臨床以減少心臟手術圍手術期的出血，對凝血、纖溶以及炎癥的發展變化都有一定影響。目前發現抑酶肽可抑制激肽釋放酶及補體系統而抑制組織損傷所致的炎癥反應；抑制一氧化氮（NO）合成酶等從而抑制自由基的產生，保護組織器官免受自由基所致的過氧化反應，從而發揮器官保護作用。盡管抑肽酶可抑制中性粒細胞的活化而降低全身炎性反應發生的程度，但其抗炎反應的確切機制尚不明確。過去的臨床或體外實驗研究[8]表明，使用抑肽酶抑制中性粒細胞的活化（如細胞表面蛋白表達，彈性蛋白酶，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-8（IL-8）的釋放）。Hill等[9]認為，抑肽酶能促進急診體外循環（Emergency extracorporeal circulation，ECC）后IL-10的釋放；Miller等[10]認為大劑量的抑肽酶能夠在下調促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8分泌的同時，上調抗炎因子IL-10的分泌，以此來平衡機體的免疫功能。

本研究應用血管內線栓法造成大鼠大腦中動脈閉塞制作局灶性腦缺血再灌注模型。HE染色結果顯示造模成功。免疫組化結果顯示，傷后24 h腦組織損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤即有明顯增加，且逐漸同步上升，至傷后10 d達到最大值，此后逐漸下降。抑肽酶組各時間點CD4+、CD8+T淋巴細胞數量均低于模型組，而增加趨勢與模型組相同。由此可以推論出抑肽酶可能通過抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的浸潤，減少神經元的凋亡，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

總之，腦缺血再灌注損傷是一個復雜的過程，有多種因素參與。本實驗從免疫炎癥反應的角度探討了抑肽酶對腦缺血再灌注損傷中的保護作用，但抑肽酶與CD4+、CD8+T淋巴細胞之間的關系，在腦缺血再灌注不同時間點如何變化有待更深入的研究。

[1]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84.

[2]李 衛，徐如祥，陳善成，等.大鼠腦組織損傷后局部及血液中細胞免疫狀況的改變[J].中華神經醫學雜志，2006，5（6）：556.

[3]Xue M，Del Bigio MR.Immune pre-activation exacerbates hemorrhagic brain injury in immature mouse brain[J].J Neuroimmunol，2005，165（1～2）：75.

[4]馬 琳，劉 勇，邵小鵬，等.大鼠腦缺血淋巴細胞浸潤的免疫組化研究[J].西安醫科大學學報，2000，21（5）：402.

[5]李 衛，陳善成，汪志剛，等.Anti-MBP與大鼠腦組織損傷后腦干繼發性脫髓鞘病變的關系[J].南方醫科大學學報，2008，28（6）：1028.

[6]李 衛，徐如祥，張 建，等.顱腦損傷患者血液及腦脊液中IgG含量的變化與病情之間的關系[J].南方醫科大學學報，2006，26（5）：703.

[7]陳克家，李 衛，汪志剛.大鼠腦組織損傷后局部細胞免疫與神經元凋亡的關系[J].南方醫科大學學報，2009，29（3）：497.

[8]Yilmaz M，Ener S，Akalin H，et al.Effect of low-dose methyl prednisolone on serum cytokine leves following extracorporeal circulation[J].Perfusion，1999，14（3）：201.

[9]Hill GE，Alonso A，Thiele GM，et al.Gluccorticoids blunt neutrophil CD11b surface glycoprotein up-regulation during cardiopulmonary bypass in humans[J].Anesth Analg，1994，79（1）：23.

[10]Miller BE，Levy JH.The inflammatory response to cardiopulmonary bypass[J].J Cardiothorac Vase Anesth，1997，11（3）：355.