古抑菌素A誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及對脆性組氨酸三聯體蛋白和凋亡相關蛋白表達的影響Δ

王麗，宋杰，劉曉燕，何濤，段承剛

（瀘州醫學院醫學分子生物學實驗室，瀘州市 646000）

肝癌是威脅人類生命健康的消化道腫瘤之一，世界衛生組織調查數據顯示，全世界每年新發現的肝癌患者中約42.5%發生在我國，且發病率和死亡率仍在不斷上升，尋找有效的治療藥物和輔助治療手段乃當務之急。研究[1，2]發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（Histone deacetylase inhibitor，HDACi）可糾正腫瘤細胞異常的乙酰化狀態，引起細胞周期的阻斷和腫瘤細胞選擇性凋亡，具有潛在抗腫瘤作用。目前HDACi中氧肟酸鹽類的Suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）、Depsipeptide（FK228）、MS-275（N，N-2-氨基苯基-氨甲基-芐基-3-氨基酸-吡啶甲基酯）和N-acetyldinaline（CI-994）等已經進入Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，有望作為非細胞毒性新型腫瘤靶向治療藥物而應用于多種惡性腫瘤的治療。氧肟酸類的古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）屬于一種特異性的HDACi，其在納摩爾級濃度便具有較高活性[3]。本研究借助體外培養技術，將不同濃度的TSA作用于人肝癌HepG2細胞，測定其抑制率和凋亡率，并應用免疫細胞化學技術研究TSA對脆性組氨酸三聯體（Fragile histidine triad，FHIT）蛋白和凋亡相關蛋白caspase-3、bax、bcl-2表達的影響，為進一步探討TSA抑瘤作用機制提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；ELX800酶標儀（美國Bio-Tek公司）；5417高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）；Tannon2500凝膠圖像掃描系統（美國BIO-RAD公司）。

1.2 細胞與試藥

人肝癌細胞株HepG2（本實驗室保存）；DMEM培養基（美國Gibco公司）；新生小牛血清（成都市華星生物化學制品廠）；二甲基亞砜（DMSO）、TSA（用 DMSO制備成濃度為1 μmol·L－1的貯存液）、MTT（美國Sigma公司）；FHIT兔抗人多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司）；β-actin兔抗人多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dTP缺口末端標記技術（TUNEL法）凋亡檢測試劑盒、SABC免疫組化染色試劑盒、3，3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒、兔抗人的caspase-3、bax以及bcl-2多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（H+L）購自中杉金橋公司；其它所用試劑均為國產或進口分析純。

2 方法

2.1 細胞培養

將HepG2接種于含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 IU·mL－1的高糖DMEM培養液中，于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養，細胞呈單層貼壁生長后每2天換液1次，生長密度達80%時用0.25 g·L－1的胰酶消化傳代。

2.2 MTT法檢測細胞增殖程度

取對數生長期的HepG2細胞經胰酶消化后計數，調整細胞密度為每毫升1×105個，接種于96孔板，每孔100 μL。待細胞貼壁后設為不同濃度TSA藥物組（125、250、500、1000、2000 nmol·L－1）、對照組（加入等體積的純DMSO）以及空白組（只加培養基不加細胞，MTT測定時用于調零），每組6復孔，分別培養24、48 h后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μL，繼續孵育4 h終止培養，小心吸棄培養上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯免疫檢測儀上以490 nm為檢測波長測量各孔的吸光度值（A），按公式：細胞抑制率＝[1－（藥物組吸光值/對照組吸光值）]×100%，計算各組細胞抑制率。

2.3 Tunel法檢測肝癌HepG2細胞的凋亡率

根據MTT法檢測結果，選擇與對照組相比差異具有統計學意義的250 nmol·L－1、1000 nmol·L－1濃度的TSA分別作為后續試驗低、高濃度TSA的代表。取指數生長期的HepG2細胞以每毫升5×105個接種于預先放有消毒蓋玻片的12孔板內制備細胞爬片，待細胞密度達90%時隨機分為2組：對照組和不同濃度TSA組，每組設3個復孔。24 h后取出細胞爬片，丙酮固定后按TUNEL法試劑盒操作說明書進行檢測，最后DAB試劑盒染色后細胞核呈棕褐色的為凋亡細胞，每張片隨機取5個高倍視野，運用Image Pro Plus（IPP）軟件分析，按公式計算細胞凋亡率：TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.4 免疫細胞化學法檢測FHIT蛋白和凋亡相關蛋白的表達

將細胞爬片取出，丙酮固定后按照免疫組化試劑盒說明書進行FHIT、caspase-3、bcl-2、bax的免疫組化染色。每個指標選取3張片子，每張片取5個高倍視野，運用Image Pro Plus（IPP）軟件分析FHIT、caspase-3、bcl-2、bax蛋白表達的累積光密度值（Integrated optical density，IOD）。IOD值越大，表明FHIT蛋白和凋亡相關蛋白的表達量越高。

2.5 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件，方差齊性檢驗后對多組間的比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用S-N-K法或Dunnett法，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 TSA對HepG2細胞增殖的影響

MTT法檢測細胞增殖情況結果見表1。

由表1可見，與對照組比較，不同濃度TSA均能抑制肝癌細胞HepG2的增殖，并隨作用濃度的升高及作用時間的延長而抑制作用增強（P＜0.05），具有藥物濃度與時間依賴性。

3.2 HepG2細胞的凋亡率

TUNEL染色結果顯示，凋亡細胞的細胞核呈棕褐色著色，多伴有核染色質高度凝聚、邊緣化；核碎裂、核固縮，產生凋亡小體，TSA組內的TUNEL陽性細胞率明顯高于對照組。對照組與250、1000 nmol·L－1TSA組作用24 h的細胞凋亡率分別為（1.57±0.26）%、（26.81±1.53）%、（35.44±2.66）%，組間細胞凋亡率比較具有顯著性差異（F＝587.71，P＜0.01）。

表1 不同濃度TSA作用后人肝癌HepG2細胞增殖情況的MTT法檢測結果（±s，n＝6）Tab 1 Results of MTT assay for the proliferation of hepatoma HepG2 cell treated with different concentrations of TSA（±s，n＝6）

表1 不同濃度TSA作用后人肝癌HepG2細胞增殖情況的MTT法檢測結果（±s，n＝6）Tab 1 Results of MTT assay for the proliferation of hepatoma HepG2 cell treated with different concentrations of TSA（±s，n＝6）

與對照組比較：＊P＜0.01；與24 h比較：△P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.at 24 h：△P＜0.01

組別對照組TSA 125 nmol·L－1 TSA 250 nmol·L－1 TSA 500 nmol·L－1 TSA 1000 nmol·L－1 TSA 2000 nmol·L－1 24 h 48 h抑制率/%－6.8112.50＊12.64＊18.18＊21.59＊13.99＜0.01 F P吸光度值0.89±0.030.85±0.040.82±0.04＊0.76±0.06＊0.76±0.02＊0.74±0.02＊17.70＜0.01抑制率/%－4.497.8714.61＊14.67＊16.85＊11.57＜0.01吸光度值0.88±0.040.82±0.040.77±0.02＊0.76±0.01＊0.72±0.02＊△0.69±0.02＊△15.63＜0.01

3.3 HepG2細胞中FHIT與凋亡相關蛋白免疫細胞化學染色結果

免疫細胞化學染色結果顯示，FHIT在HepG2細胞中的陽性表達呈棕黃色，凋亡相關蛋白在HepG2細胞中的陽性表達呈紫藍色。與對照組比較，加入TSA作用24 h后，胞質的棕黃色細顆粒明顯增加，表明FHIT蛋白的表達量升高，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.01）；caspase-3、bax的紫藍色著色隨TSA濃度的增加而逐漸加深，表明caspase-3、bax蛋白的表達出現增強，與對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05），而bcl-2的變化各組間比較差異不明顯。各組結果詳見表2。

表2 各組FHIT、caspase-3、bax、bcl-2蛋白表達的定量分析結果（±s，n＝15）Tab 2 Quantitative analysis of the protein expression of FHIT，caspase-3，bax and bcl-2（±s，n＝15）

表2 各組FHIT、caspase-3、bax、bcl-2蛋白表達的定量分析結果（±s，n＝15）Tab 2 Quantitative analysis of the protein expression of FHIT，caspase-3，bax and bcl-2（±s，n＝15）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

TSA濃度/nmol·L－1 0（對照）2501000 IOD F P bcl-235898.26±3187.5937118.77±3576.4739445.08±1490.591.94＞0.05 FHIT 12346.36±4436.3137118.77±3576.47＊＊158884.63±28605.07＊＊43.60＜0.01 caspase-337950.34±3016.91105175.80±13343.62＊＊122314.50±11301.53＊＊94.72＜0.01 bax 70182.68±6510.72129870.70±42714.72＊152150.17±17612.56＊＊14.85＜0.01

4 討論

TSA作為一種特異的HDACi，因其高效、低毒的特點而被廣泛運用于多種腫瘤細胞的治療研究中。本試驗的研究結果顯示，TSA可明顯抑制肝癌HepG2細胞的生長，且抑制作用具有時間和濃度依賴性，提示TSA通過干預組蛋白的乙酰化水平，改變細胞的基因表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖。TUNEL法檢測細胞凋亡情況顯示，TSA作用組TUNEL陽性細胞百分率呈上升趨勢，并隨TSA濃度的增加各組細胞凋亡率出現顯著增加，說明TSA對肝癌HepG2細胞具有顯著的致凋亡作用，證實TSA對肝癌細胞的抗腫瘤效應。

TSA可通過誘導腫瘤細胞生長阻滯、分化和凋亡，阻止腫瘤的浸潤和轉移，抑制腫瘤血管和淋巴管的生成等多種途徑發揮抗腫瘤效應。為揭示TSA對肝癌HepG2細胞的促凋亡作用機制，筆者進一步通過免疫細胞化學法對FHIT蛋白和凋亡相關蛋白caspase-3、bax、bcl-2表達情況進行了檢測。FHIT基因是1996年Ohta等用定位克隆技術及外顯子捕獲法在3p14.2區分離鑒定出的一個新基因，后研究[4]發現在多種原發性腫瘤及腫瘤細胞株中都存在FHIT基因的轉錄異常和FHIT蛋白的缺失或低表達，提示該基因可能是一種抑癌基因。Pichiorri、Vecchione等[5，6]研究發現人工誘導FHIT蛋白的過表達可抑制腫瘤細胞的生長和腫瘤的形成，并且這種抑制作用與其誘導細胞凋亡、調控細胞周期密切相關。TSA誘導的肝癌細胞凋亡事件是否與FHIT表達相關的研究目前尚未見報道，筆者的研究結果顯示，TSA可導致細胞中FHIT、caspase-3和bax表達增強，而對bcl-2無明顯作用，提示FHIT、caspase-3和bax可能參與了TSA誘導的肝癌細胞凋亡發生，并且TSA可能是通過直接或上調FHIT的表達后間接啟動凋亡機制發揮其促凋亡作用。

TSA雖具有抑制腫瘤細胞生長增殖的作用，但目前認為其單獨使用臨床療效欠佳，還需尋找其它藥物合用。有研究[7，8]發現美洛昔康、丙戊酸鈉對人肝癌HepG2細胞具有明顯的增殖抑制促凋亡作用，若將TSA與這些藥物聯合運用，可望更大程度地殺滅腫瘤細胞，這也是筆者后期將陸續開展的研究工作。

本試驗以HepG2細胞為研究對象，通過觀察TSA對其增殖抑制作用，闡明了TSA可能通過上調FHIT、caspase-3和bax的表達而促進細胞凋亡的發生，以上結果為揭示TSA作用肝癌細胞的可能機制、開發聯合治療方案提供了理論依據。

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[5]Pichiorri F，Trapasso F，Palumbo T，et al.Preclinical assessment of FHIT gene replacement therapy in human leukemia using a chimeric adenovirus，Ad5/F35[J].Clin Cancer Res，2006，12（11 Pt 1）：3494.

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[7]李 攀，趙春景.美洛昔康對人肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用[J].中國藥房，2007，18（10）：744.

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