白介素-4和免疫球蛋白E含量指標(biāo)在快速檢測(cè)藥物引起過敏反應(yīng)中的作用研究Δ

肖貴南，盛英美，陳浩桉，李建定

（1.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州市 510180；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣州市 510089）

藥物注射劑引起的過敏反應(yīng)呈逐年增加的趨勢(shì)，而其檢測(cè)方法主要參照2005年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的豚鼠過敏反應(yīng)檢查法，存在檢驗(yàn)周期偏長(zhǎng)（2～3周）、直接觀察過敏反應(yīng)指標(biāo)（豎毛、咳嗽、噴嚏等）不夠客觀等缺陷[1]。本文以經(jīng)過常規(guī)過敏反應(yīng)檢查法證實(shí)能引起過敏的中藥注射劑及生化制劑為例，通過建立連續(xù)靜脈注射致敏方法，探討檢測(cè)血清中白介素-4（IL-4）和免疫球蛋白E（IgE）抗體在快速判斷藥物引起的過敏反應(yīng)中的可行性，并與常規(guī)法定方法進(jìn)行比較，為藥物引起的過敏反應(yīng)提供一種新型的快速檢測(cè)途徑。

1 材料

1.1 試藥

清開靈注射液（吉林某藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：090118-6，規(guī)格：每支10 mL）；香丹注射液（浙江某藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：080524，規(guī)格：每支10 mL）；腦蛋白水解物注射液（吉林某藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：081201，規(guī)格：每支5 mL）；喘可治注射液（廣州健心藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20071102，規(guī)格：每支2 mL）；馬血清（廣州蕊特生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：090318，規(guī)格：每瓶100 mL）；生理鹽水（昆明市宇斯藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：08070204，含量：9 g·L－1，規(guī)格：每瓶100 mL）；IL-4和總IgE測(cè)定試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.2 動(dòng)物

Hartery品系的豚鼠，♀♂各半，體質(zhì)量：280～320 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2008A0026。

1.3 儀器

Elx808酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應(yīng)的時(shí)效性

取豚鼠32只，按攻擊時(shí)間不同分為4組（d 7、d 8、d 9、d 10攻擊組），每組8只，♀♂各半，各組豚鼠均分別于d 0、d 1、d 2靜脈注射10%馬血清0.5 mL進(jìn)行致敏，共注射3次，分別對(duì)應(yīng)于d 7、d 8、d 9、d 10各組取全部豚鼠8只，從豚鼠足背中靜脈取血1 mL，3000 r·min－1離心15 min，分離血清測(cè)定IL-4和總IgE。取血后的各只豚鼠再?gòu)年幥o背靜脈注射1次馬血清1.0 mL進(jìn)行攻擊，觀察并記錄豚鼠整體過敏反應(yīng)的發(fā)生情況。另取未經(jīng)任何處理的豚鼠8只作為空白組，取靜脈血離心分離血清，以酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定空白IL-4和總IgE。

2.2 靜脈注射藥物引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應(yīng)的快速檢查

取豚鼠40只，♀♂各半，隨機(jī)分為5組：生理鹽水組、清開靈注射液組、香丹注射液組、腦蛋白水解物注射液組、喘可治注射液組，每組8只，♀♂各半，各組豚鼠分別于d 0、d 1、d 2靜脈注射上述供試品原液0.5 mL，每只豚鼠共注射3次進(jìn)行致敏，并于d 8從豚鼠足背中靜脈取血1 mL，分離血清，測(cè)定IL-4和總IgE。再?gòu)年幥o背靜脈注射相應(yīng)供試液1.0 mL進(jìn)行攻擊，觀察并記錄豚鼠整體過敏反應(yīng)的發(fā)生情況。

2.3 藥物腹腔注射過敏反應(yīng)檢查方法及IL-4和總IgE水平的測(cè)定

取豚鼠隨機(jī)分為6組：生理鹽水組、馬血清組、清開靈注射液組、香丹注射液組、腦蛋白水解物注射液組、喘可治注射液組，每組12只，馬血清濃度為10%，各組豚鼠分別于d 0、d 2、d 4腹腔注射相應(yīng)供試液0.5 mL進(jìn)行致敏。于d 14、d 21時(shí)，每組分別各取6只豚鼠從足背中靜脈取全血1 mL，分離血清測(cè)定IL-4和總IgE水平。取血后的各組6只豚鼠再?gòu)年幥o背靜脈注射相應(yīng)供試液1.0 mL進(jìn)行攻擊，觀察并記錄豚鼠整體過敏反應(yīng)的發(fā)生情況。

2.4 ELISA法測(cè)定血清IL-4和總IgE水平

血清存放于－30℃冰箱中，1月內(nèi)進(jìn)行IL-4和總IgE水平的測(cè)定；采用雙抗夾心ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5 豚鼠過敏反應(yīng)的判斷

參照2005年版《中國(guó)藥典》附錄的標(biāo)準(zhǔn)，觀察豚鼠注射供試液進(jìn)行攻擊后30 min內(nèi)有無(wú)噴嚏、抽搐、休克等過敏反應(yīng)發(fā)生。如豚鼠發(fā)生豎毛、噴嚏、干嘔、連續(xù)咳嗽3聲和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者，判為過敏反應(yīng)陽(yáng)性。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應(yīng)的時(shí)效性

豚鼠整體實(shí)驗(yàn)情況：連續(xù)3 d靜脈注射致敏后，d 7攻擊的8只豚鼠中有5只出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果（3只死亡），d 8及以后各組8只豚鼠均在攻擊后5 min內(nèi)出現(xiàn)過敏反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果（每組有4只豚鼠死亡）。

空白組豚鼠血清的IL-4和總IgE水平分別為（92.4±11.8）ng·L－1（n＝8）、（43.3±6.3）IU·mL－1（n＝8）。血清中IL-4和總IgE水平結(jié)果見表1。

表1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高的時(shí)效性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1 The time-effectiveness of the increase of IL-4 and IgE caused by horse serum（±s，n＝8）

表1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高的時(shí)效性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1 The time-effectiveness of the increase of IL-4 and IgE caused by horse serum（±s，n＝8）

與空白組相應(yīng)的指標(biāo)比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.relevant index of blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

由表1可見，注射馬血清進(jìn)行致敏后，豚鼠血清IL-4和總IgE水平在d 7時(shí)開始升高（P＜0.05），d 8起出現(xiàn)急劇升高（P＜0.01），與空白組的相應(yīng)指標(biāo)相比，均有顯著性差異。

上述整體實(shí)驗(yàn)及ELISA法測(cè)定結(jié)果提示：連續(xù)3 d靜脈致敏后的d 8起，豚鼠可出現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)和IL-4及總IgE水平升高，因而以下靜脈致敏的過敏反應(yīng)檢查均以d 8為準(zhǔn)，以此反映過敏反應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間。

3.2 靜脈注射藥物引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應(yīng)的快速檢查

豚鼠整體實(shí)驗(yàn)情況：靜脈致敏d 8后，除了生理鹽水組和喘可治注射液組豚鼠未出現(xiàn)過敏反應(yīng)外，其余各組8只豚鼠均出現(xiàn)了過敏反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果。

血清中IL-4和總IgE水平測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 靜脈注射致敏藥物d 8時(shí)各組豚鼠血清中IL-4和總IgE水平（±s，n＝8）Tab 2 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 8 days after intravenous administration of allergic agents（±s，n＝8）

表2 靜脈注射致敏藥物d 8時(shí)各組豚鼠血清中IL-4和總IgE水平（±s，n＝8）Tab 2 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 8 days after intravenous administration of allergic agents（±s，n＝8）

與生理鹽水組相應(yīng)的指標(biāo)比較：＊P＜0.01，#P＜0.01vs.relevant index of normal saline group：＊P＜0.01，#P＜0.01

表2結(jié)果顯示，靜脈注射致敏后d 8，與生理鹽水組比較，喘可治注射液組豚鼠血清IL-4和總IgE水平維持在正常水平（P＞0.05），其余各組豚鼠血清IL-4和總IgE水平均升高（P＜0.01）。靜脈致敏后，豚鼠整體出現(xiàn)過敏反應(yīng)的時(shí)間（d 8）與攻擊前豚鼠血清IL-4和總IgE水平升高時(shí)間（d 8）相平行。

3.3 藥物腹腔注射過敏反應(yīng)檢查方法及IL-4和總IgE水平測(cè)定

豚鼠整體實(shí)驗(yàn)情況：各組豚鼠隔日腹腔注射藥物致敏后，在d 14和d 21，以同種供試液進(jìn)行攻擊，生理鹽水組和喘可治注射液組豚鼠未出現(xiàn)過敏反應(yīng)，其余各組豚鼠均在攻擊后出現(xiàn)了過敏反應(yīng)，馬血清組還有4只豚鼠死亡。

IL-4和總IgE水平測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 腹腔注射致敏藥物d 14、d 21時(shí)各組豚鼠血清中IL-4及總IgE水平（±s，n＝6）Tab 3 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 14 days and 21 days after intraperitoneous administration of allergic agents（±s，n＝6）

表3 腹腔注射致敏藥物d 14、d 21時(shí)各組豚鼠血清中IL-4及總IgE水平（±s，n＝6）Tab 3 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 14 days and 21 days after intraperitoneous administration of allergic agents（±s，n＝6）

與生理鹽水組相應(yīng)的指標(biāo)比較：＊P＜0.01，#P＜0.01vs.relevant index of normal saline group：＊P＜0.01，#P＜0.01

表3結(jié)果表明，常規(guī)方法致敏后d 14和d 21，與生理鹽水組相比，喘可治注射液組豚鼠血清IL-4和總IgE水平維持在正常（P＞0.05），其余各組豚鼠血清IL-4和總IgE水平均升高（P＜0.01），與表1、表2的靜脈注射致敏結(jié)果一致。

4 討論

藥物引起的過敏反應(yīng)以速發(fā)型過敏反應(yīng)最為常見、危害也最大，現(xiàn)有判斷藥物引起過敏反應(yīng)的方法主要有直接檢測(cè)過敏物質(zhì)、被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、豚鼠回腸條實(shí)驗(yàn)、豚鼠主動(dòng)過敏反應(yīng)檢查法等[2，3]，上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法存在檢驗(yàn)周期偏長(zhǎng)、過敏反應(yīng)觀察指標(biāo)不夠客觀等缺陷，不利于迅速得出結(jié)論。

IgE抗體在速發(fā)型過敏反應(yīng)發(fā)病機(jī)制中的作用己成定論，而IL-4是輔助T細(xì)胞衍生的一類細(xì)胞因子，是促進(jìn)IgE合成的最主要細(xì)胞因子，過敏原進(jìn)入機(jī)體后引起IL-4和IgE升高并可保持較長(zhǎng)時(shí)間，使機(jī)體始終處于一個(gè)高敏狀態(tài)，再次遇到同一過敏原時(shí)可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)[4]，因而提供了一個(gè)可供快速檢測(cè)藥物引起過敏反應(yīng)的新思路。

本文對(duì)近2年廣東省藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)的上述4個(gè)國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)品種進(jìn)行了過敏反應(yīng)的對(duì)比檢查研究。對(duì)傳統(tǒng)的隔日腹腔注射致敏法的給藥途徑和間隔周期進(jìn)行了改進(jìn)，采用連續(xù)3 d靜脈注射致敏法，證明在靜脈致敏的d 8，陽(yáng)性藥物攻擊前豚鼠血清IL-4和總IgE水平明顯升高，最終結(jié)果與傳統(tǒng)的腹腔致敏法一樣，均可有效判斷藥物引起的過敏反應(yīng)，且比傳統(tǒng)方法判斷過敏反應(yīng)的時(shí)間提早1～2周。

本研究結(jié)果提示，血清IL-4和總IgE水平可望成為早期檢測(cè)藥物引起的過敏反應(yīng)的靈敏指標(biāo)，它反映了藥物靜脈注射致敏豚鼠后d 8就出現(xiàn)的過敏反應(yīng)，避免了常規(guī)方法所存在的缺陷，符合新版《中國(guó)藥典》關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)藥物過敏反應(yīng)檢查方法的研究方向，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄101.

[2]胡昌勤，許明哲，馬 越，等.含丹參的中藥注射液中過敏性雜質(zhì)的檢測(cè)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（5）：518.

[3]Pullerits T.Cytokine modulation for anti-allergic treatment[J].Curr Pharm Des，2002，8（20）：1845.

[4]Bettiol J，Sele J，Henket M，et al.Cytokine production from sputum cells after allergenic challenge in IgE-mediated asthma[J].Allergy，2002，57（12）：1145.