均勻設(shè)計法優(yōu)化抗暈動中藥處方

陳 艷，許景峰，王金萍，曾 明，趙維娟（北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京市 100700）

暈動病又稱運動病，是指機體暴露于被動運動環(huán)境中，由于定向功能和平衡功能失調(diào)引起的的一系列植物神經(jīng)功能亢進的應(yīng)激反應(yīng)[1]，表現(xiàn)為眩暈、惡心、嘔吐等。目前，暈動病的治療主要通過西藥抑制嘔吐中樞，這些藥物的局限性是具有明顯的自主神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用，大多有鎮(zhèn)靜作用。中藥抗暈動病療效確切，用藥安全，因此抗暈動中藥的研究具有特殊意義。

Michell[2]認為，大鼠無嘔吐反射，在遭受前庭刺激后出現(xiàn)異嗜行為，相當(dāng)于其它動物的嘔吐癥狀。于旭紅等[3]經(jīng)過大量實驗發(fā)現(xiàn)并驗證了一種抗暈動病藥物篩選和評價的新方法——暈反應(yīng)指數(shù)評價法。本研究通過預(yù)試驗初步篩選出了3味抗暈動中藥：生姜、藿香和木香。為了證明其抗暈動效果，并進一步確定達最大抗暈動藥效三者間的最佳配比，筆者采用均勻設(shè)計安排各試驗點，以小鼠旋轉(zhuǎn)刺激誘發(fā)暈動病，以暈反應(yīng)指數(shù)為評價指標(biāo)進行處方優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1050 series高效液相色譜（HPLC）儀，包括Agilent 1050四元泵、G79853A紫外檢測器、Agilent 1050色譜工作站（美國惠普公司）；純水系統(tǒng)（美國HiTech公司）；JA2003 M型電子天平（上海天平儀器廠）；WTD500A型可控性三臂式旋轉(zhuǎn)儀、塑料掛籃（高30 cm、直徑15 cm）由第二軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室自制。

1.2 試藥

生姜（山東安丘白芬子鎮(zhèn)）、廣藿香（江西吉水縣水南藥用百草油提煉廠）、木香（本院中藥房領(lǐng)取）經(jīng)筆者薄層及氣相鑒別為真品；6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司，批號：6-JF-070711，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、IR、UV、MS鑒定為6-姜酚，經(jīng)HPLC法檢查純度＞98%）；木香烴內(nèi)酯（CT）、去氫木香內(nèi)酯（DL）對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為111524-200503、111525-200706）；茶苯海明（北京益民藥業(yè)有限公司，批號：080512）；吐溫-80（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 動物

清潔級昆明種小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量（18～22）g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2007-0003）。小鼠隨機分為處方1組、處方2組、處方3組、處方4組、處方5組、茶苯海明組和空白對照組，每組10只，♀♂各半。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的提取與檢測

2.1.1 姜油的萃取：取生姜鮮品，切片，自然晾干，按2005年版《中國藥典》[4]精密稱取適量進行超臨界CO2（SFE-CO2）萃取得姜油。優(yōu)化后的萃取工藝為：萃取溫度45℃，萃取壓力30 MPa，二級高壓萃取釜萃取浸泡時間2.5 h，流體取樣量約5 mL，取樣過程氣體流速0.3～0.9 L·min-1。用HPLC法測得提取物中6-姜酚的含量為19.023%，表明提取物質(zhì)量較好。

2.1.2 廣藿香揮發(fā)油的提取：以莖葉比2∶8取廣藿香藥材，粉碎，過2號篩（24目），混合均勻，精密稱取藥材碎末，置揮發(fā)油提取器的2000 mL硬質(zhì)圓底燒瓶中，加水800 mL，加入幾粒沸石，充分振搖混勻后加塞密閉浸泡2 h，接通冷凝水，緩緩加熱燒瓶至微沸并保持微沸，調(diào)節(jié)冷凝水的大小使餾出液的溫度低于40℃，直至揮發(fā)油的體積不再增加，停止加熱，收集油層部分。照2005年版《中國藥典》的氣相色譜法[6]對提取物進行含量測定。本品含百秋李醇為26.12%，符合規(guī)定。

2.1.3 木香的提取：將木香藥材粉碎，精密稱取適量，按正交試驗優(yōu)化的最佳工藝進行回流提取：10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次1 h。本研究采用水浴回流，溫度控制在84℃左右。用紗布粗濾后再用濾紙過濾，收集樣品提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收乙醇，并將提取液進行濃縮。采用HPLC法進行測定[5]，每1 g木香藥材提取木香烴內(nèi)酯13.485 mg、去氫木香內(nèi)酯16.252 mg。

2.2 均勻設(shè)計方法

2.2.1 因素水平：大量文獻的調(diào)查及預(yù)試驗結(jié)果初步確定3個考察因素及其水平的基本范圍為：生姜0～80 g，藿香0～60 g，木香0～10 g，水平數(shù)≥5。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

2.2.2 均勻設(shè)計試驗結(jié)果：由于因素為3，m/2+1＝3，m＝4（m為最多可安排的列數(shù)），n＝m+1＝5（n為行數(shù)），故選取均勻分布表U5（54）。由于本研究只有3因素，則從相應(yīng)的使用表中查得因素為3時對應(yīng)的列號是1、2、4列，因此組成5行3列的U5（53）表，其中1～5組為試驗組，第6組為使用茶苯海明作對照藥的陽性對照組，第7組為空白對照組。均勻設(shè)計試驗結(jié)果見表2。

表2 均勻設(shè)計試驗結(jié)果Tab 2 Results of optimizing experiment

2.3 藥效學(xué)實驗

2.3.1 刺激量的設(shè)定：旋轉(zhuǎn)器為可控性三臂式旋轉(zhuǎn)儀，三臂的臂長均為28 cm，每臂掛3只掛籃，每只掛籃放動物1只。實驗時小鼠無束縛地放入旋轉(zhuǎn)器塑料掛籃內(nèi)，繞垂直軸水平旋轉(zhuǎn)。處方1～5組及茶海拉明組、空白對照組給予的刺激量均為：以80次·min-1順時針方向旋轉(zhuǎn)1 min，然后逆時針方向旋轉(zhuǎn)1 min，如此反復(fù)持續(xù)刺激動物90 min致暈。

2.3.2 給藥量：分別以表2中實驗1～5組中各藥材的量，按每20 g小鼠體質(zhì)量給予劑量的0.0026倍量進行ig給藥，生姜、藿香和木香的劑量分別按提取率折算成提取產(chǎn)物（以2%吐溫-80溶液配制，每20 g小鼠體質(zhì)量的給藥體積為0.3 mL）；茶苯海明組：每20 g小鼠體質(zhì)量給予0.13 mg茶苯海明（以2%吐溫-80溶液溶解藥物，每20 g小鼠體質(zhì)量的給藥體積為0.3 mL）；空白對照組：ig等量2%吐溫-80溶液。

2.3.3 評價指標(biāo)：♀♂小鼠分別飼養(yǎng)在代謝籠內(nèi)，可自由飲水和進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，每次于實驗開始的前一天晚上12∶00左右給小鼠禁食，可自由飲水，第二天早上8∶00左右開始實驗。取同性別小鼠各組1只分別按上述劑量進行ig給藥，給藥后30 min以上述旋轉(zhuǎn)刺激方式和時間進行旋轉(zhuǎn)刺激，刺激結(jié)束后將動物置于地面，立即觀察動物的反應(yīng)。所有的反應(yīng)均在旋轉(zhuǎn)結(jié)束后2 min內(nèi)產(chǎn)生，計算出暈反應(yīng)指數(shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 3 Scoring criteria

2.3.4 結(jié)果：受刺激前小鼠皮毛光滑，反應(yīng)靈敏。隨著刺激時間的延長，小鼠全身毛皮聳立蓬松，排便、尿次數(shù)明顯增多，活動明顯減少，部分小鼠出現(xiàn)顫抖、煩躁不安、多動、咀嚼等現(xiàn)象。刺激停止后60 min逐漸恢復(fù)。

由于實驗5 d每天的天氣晴陰、環(huán)境因素不同均會影響小鼠的暈反應(yīng)強度，為使數(shù)據(jù)具有可比性，1～5 d必須分天統(tǒng)計，每天以茶苯海明組的兩輪暈反應(yīng)指數(shù)之和為100%，其它各組的兩輪暈反應(yīng)指數(shù)之和除以當(dāng)天茶苯海明組兩輪暈反應(yīng)指數(shù)之和作為暈動率，以5 d暈動率之和為統(tǒng)計量，旨在減少實驗誤差。暈反應(yīng)指數(shù)測定結(jié)果見表4。

3 討論

表4 暈反應(yīng)指數(shù)測定結(jié)果Tab 4 Results of MS index

由于隨時間的推移動物的饑餓狀態(tài)和環(huán)境等發(fā)生變化，禁食至下午的小鼠暈反應(yīng)不明顯，因此實驗分5個上午進行，每個上午進行兩輪，每輪分別取1～7組每組1只同性別小鼠進行實驗。

利用Uniform Design Version 2.20均勻設(shè)計軟件采用全回歸法對表4中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得多元線性回歸模型無效，即線性不顯著。根據(jù)均勻設(shè)計的理論，可以利用均勻設(shè)計的試驗點布點均勻、代表性強的特性，用直接觀察法從所有試驗中挑選表現(xiàn)最好的試驗條件組合而結(jié)束試驗設(shè)計（不再進行數(shù)據(jù)的分析處理）。從表4中可以看出，處方1、2組的暈反應(yīng)指數(shù)顯著低于茶苯海明組，說明處方1、2組的抗暈效果顯著強于茶苯海明藥，其中處方2組的暈反應(yīng)指數(shù)最低，抗暈效果最好；處方3、5組的暈反應(yīng)指數(shù)與茶苯海明組較接近，其中處方3的抗暈作用略強于茶苯海明，處方5略弱于茶苯海明；處方4組的暈反應(yīng)指數(shù)顯著高于茶苯海明組，抗暈效果較差。

采用SPSS統(tǒng)計軟件對表4中各組暈動率進行統(tǒng)計處理，2組間比較采用非配對t檢驗，多組間比較采用ANOVA方差分析。結(jié)果表明，處方1、2顯著優(yōu)于茶苯海明，處方4顯著弱于茶苯海明。因此，選定處方2（生姜60 g，藿香45 g，木香5 g）為最佳處方。

[1]王爾貴，薛龍增，張炳新，等.暈動病的病因及防治[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2002，10（4）：276.

[2]Michell D.Motion Sickness-induced pica in rats[J].Clin Nutr，1977，30：147.

[3]于旭紅，蘇定馮.抗運動病新藥的研究：從新的動物模型到新的模型動物[D].第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文，2007.

[4]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：30、66.

[5]童榮生，孫世明，吳正中.反相高效液相色譜法測定理氣復(fù)胃口服液中木香烴內(nèi)酯的含量[J].中國藥房，2006，17（3）：211.