白蛋白酶聯免疫分析試劑盒的研制

官國英,劉忠瑞,李麗波,侯惠仁,王晶晶,韓世泉

(中國原子能科學研究院同位素研究所,北京 102413)

白蛋白(Albumin,Alb)是血漿的主要成分,由肝臟產生,相對分子質量為66 300。當腎臟病變時,腎小球濾過膜通透性發生改變,孔徑變大,Alb漏出,尿液中Alb升高。尿中白蛋白排出量的多少,可反映腎小球損傷的程度,是診斷腎小球腎病的靈敏指標。尿白蛋白測定用于腎臟病的早期診斷,也是目前檢查糖尿病以及高血壓患者腎臟早期損傷的最靈敏的方法之一[1-2]。尿白蛋白與β2-微球聯合測定,可用于鑒別診斷腎臟損傷的部位。尿白蛋白測定在腎臟移植及腎小球藥物損傷的監測等方面亦有一定的價值[3]。

傳統的測定尿白蛋白的方法主要有放射免疫法、免疫比濁法、高效液相色譜法、酶聯免疫法等。放射免疫法靈敏度、精確度較高,但是實驗過程復雜,儀器昂貴;免疫比濁法簡單方便,但是試劑昂貴,不適合大批量的樣本篩選;高效液相色譜法處理過程復雜,操作過程繁瑣,不適用于臨床推廣應用;酶聯免疫法儀器簡單,操作簡便、快速,適用于臨床檢測和科研應用。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

酶標儀:奧地利SLT公司產品,電熱培養箱:上海躍進醫療器械廠產品。

1.2 主要試劑

Alb、辣根過氧化物酶(H RP)、四甲基聯苯胺(TMB)、過氧化氫(H 2O2):美國 Sigma公司產品;Alb多克隆抗體:原子高科股份有限公司產品。

2 實驗方法

2.1 Alb酶標記物(Alb-HRP)的制備

采用高碘酸鈉標記法對Alb進行酶標記[4-5]。稱取1.0 mg HRP溶于0.1 mL雙蒸水中,攪拌下加入0.1 mL新鮮配制的0.06 mol/L高碘酸鈉(NaIO4)水溶液,4℃靜置30 min;取出,攪拌下加入0.1 mL 0.16 mol/L乙二醇水溶液,室溫靜置30 min。將 0.5 mL(1.0 mg)Alb的水溶液加入上述溶液中,混勻后,裝入透析袋對0.05 mol/L p H 9.5的碳酸鹽緩沖液4℃透析過夜;次日,將溶液自透析袋取出,加入0.04 mL(5 g/L)新配制的NaBH 4蒸餾水溶液,混勻,4℃下靜置2 h。取出反應液,裝入透析袋對0.02 mol/L p H 7.4的PB 4℃透析過夜,取出透析液,此即為Alb-HRP。在透析液中加等體積甘油,于-20℃貯存備用。

2.2 固相抗體的制備

向聚苯乙烯微量滴定板孔中加入含有Alb多克隆抗體的p H9.6碳酸緩沖液(200μL/孔),置4℃冰箱內過夜,37℃封閉1 h,此酶標板可用于免疫反應。

2.3 Alb標準品的配制

用含0.2%BSA的0.01 mol/L,p H7.4的PBS將已知濃度的Alb濃液按要求依次稀釋,配制成 1.0、2.0、5.0、10.0 、20.0 和 50 mg/L 的系列標準品,分裝,凍干,4℃下貯存備用。

2.4 底物溶液和終止劑

將TMB和H 2O2分別溶于pH 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液中,使其濃度分別為 0.6、1.2 mmol/L,使用時以體積比1∶1混合,此即為底物溶液。終止劑為2 mol/L H2SO4溶液。

2.5 Alb-ELISA分析程序

采取一步法加樣程序,以20μL/孔待測樣品或標準品和200μL/孔酶標記物加入包被有Alb多克隆抗體的微量滴定板中,混勻,37℃溫育40 min,棄反應液,用洗滌液(含 0.05%Tween-20)洗 5次,加入底物液 200 μL/孔,避光,37℃下顯色 15 min,以 2 mol/L H 2 SO4溶液以每孔50μL終止顯色,于450 nm處測定其光密度OD450。繪制標準曲線,計算樣品中Alb含量。

3 結果與討論

3.1 方法學建立

3.1.1 Alb-HRP滴度的選擇

用含0.2%BSA的PBS將Alb-HRP稀釋為 1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000和 1∶5 000的工作液,用于Alb-ELISA實驗,Alb的4個標準點為 0、1.0、20.0 和 50.0 mg/L,分別用 A 、B、F和G表示,其吸光度OD450及各標準點與A點的吸光度之比(B/B0)列于表1。分析表1可知,Alb-HRP滴度為1∶3 000時,標準點B、F、G 與A 的 B/B0分別為 81.5%、20.0%、11.8%,說明曲線的抑制效果好,可以滿足免疫分析的要求。

3.1.2 標準品和 Alb-HRP加樣量對Alb-ELISA的影響

Alb的7個標準點(A 、B、C、D 、E、F和 G,濃度分別為 0、1.0、2.0、5.0 、10.0、20.0 和50.0 mg/L)和 Alb-H RP分別加樣 20μL+200μL、50μL+150μL進行Alb-ELISA 實驗,實驗結果列于表2。表2顯示,加樣量為20+200 μL 時,B、C 、D 、E 、F 、G 點與 A 點的 B/B0分別為 82.7%、62.7%、39.1%、24.8、17.5、9.7%。此結果表明,標準曲線有較高的靈敏度,較好的抑制曲線,可以滿足免疫分析要求。

表1 Alb-HRP滴度的選擇

表2 標準品和Alb-HRP加樣量對Alb-ELISA的影響

3.2 方法學鑒定

3.2.1 標準曲線與靈敏度

按照Alb-ELISA分析程序分析各標準點的OD450,以標準品的濃度為橫坐標(對數坐標),OD450為縱坐標(普通坐標),在半對數坐標紙上繪出Alb-ELISA標準曲線,結果示于圖1。同時測定20個零標準的OD450,以其平均值減去2s計算其分析靈敏度為0.28 mg/L。

圖1 Alb-ELISA標準曲線

3.2.2 精密度

重復測定3份不同濃度的Alb樣品,觀察批內、批間變異,實驗結果列于表 3。表3顯示,批內變異為2.63%～5.28%,批間變異為2.40%～4.26%。該結果表明,本工作所研制的試劑盒的精密度滿足免疫分析的要求。

表3 Alb-ELISA試劑盒的批內批間變異

3.2.3 準確性

取3份不同濃度的Alb樣品分別加入已知濃度的Alb標準品中,測定Alb回收率,結果列于表4。表4顯示,回收率為95.0%～106.4%,符合免疫分析要求。

表4 樣品回收實驗

3.2.4 稀釋實驗

取Alb含量較高的樣品用Alb“零”標準進行倍比稀釋,測定結果列于表 5。經計算,Alb測定值與稀釋度線性相關方程為y=32.81x+0.72,相關系數為r=0.997 4,該結果符合免疫分析要求。

表5 樣品倍比稀釋實驗

3.3 正常尿液樣品的檢測

采用所建立的白蛋白酶聯免疫試劑盒檢測52份正常人尿樣品,測定結果顯示,其白蛋白含量小于12 mg/L,與文獻[6]基本一致,符合臨床測定要求。

4 小 結

本試劑盒通過條件優化實驗,找到合適的反應體系,建立了Alb酶聯免疫分析方法,方法的分析靈敏度、精密度、準確性、臨床測定值均達到免疫分析要求。

[1] 戴世榮.尿微量蛋白在糖尿病腎病中的應用價值[J].臨床檢驗,2002,15(5):506.

[2] 陳玉霞,李鳳敏,代軍,等.尿微量白蛋白在高血壓病腎損害診斷中的價值探討[J].甘肅科技,2006,22(6):193-194.

[3] 王自正.現代標記免疫學[M].北京:人民軍醫出版社,2000:249.

[4] 郭春祥,郭錫瓊.介紹一種簡單、快速的辣根過氧化物酶標記物酶標記抗體的過碘酸鈉法[J].免疫學雜志,1983,33:97-100.

[5] 劉佳寧,劉一兵,賈娟娟,等.促黃體生成激素酶促化學發光免疫分析方法的建立[J].同位素,2010,23(1):28-33.

[6] 朱敏,邵愛華,張哲,等.各種腎病患者尿微量蛋白測定結果觀察[J].浙江中醫學院學報,2003,27(5):31-32.