不同外源激素及培養方式對甘草試管苗生長的影響

余 斌,劉 娟,劉 昕,黃慧英,王 清

(1.甘肅農業大學農學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業大學生命科學技術學院,甘肅蘭州 730070;3.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

甘草(Glycyrrhiza uralensis)為豆科甘草屬多年生草本植物,根和根莖具有極高的藥用價值[1],素有“國老”、“十方九草”之譽[2]。同時,甘草在食品、飲料、卷煙、化妝品等行業中都有廣泛的應用[3]。近10年,人們破壞性地采挖野生甘草,使野生甘草種群面積迅速減小,種群質量不斷下降,甘草資源面臨嚴重危機[4,5]。為了保護甘草這一寶貴的種質資源,同時滿足國內外市場對甘草日趨劇增的需求,迫切需要開展大面積人工栽培甘草。但由于野生甘草種子發芽率極低(5%～10%),而甘草的組織培養可以很好的解決這一問題。組織培養技術中試管苗培養體系對培養物的生長狀態,增殖及分化方向有著較大的影響,是組織培養技術中的關鍵因素[6]。所以進行甘草試管苗培養體系的優化對,開展組織培養快速繁殖甘草苗就具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘肅省廣泛種植的烏拉爾甘草,由甘肅農業大學生命科學技術學院作物遺傳育種教研室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的擴繁培養 挑選籽粒飽滿的甘草種子,用70%的酒精浸泡2～3 min,然后15%的84消毒液浸泡15～20 min,再用無菌水漂洗3～4次。將消毒后的種子接種在經高壓滅菌的MS固體培養基中(pH 5.8),每個三角瓶接15～20粒種子,待種子萌發并形成4～5片真葉的幼苗時作為試驗的備用材料。

1.2.2 不同培養方式及不同外源激素下甘草試管苗的形成 將甘草幼苗剪切成兩葉莖段,接種在固體、液體和固液雙層培養基中培養。每種培養方式均設置5種培養基配方,分別為:

①MS+1.0 mg/L IBA+13.5 mg/L KH2PO4

②MS+13.5 mg/L KH2PO4

③MS+1.0 mg/L IAA+13.5 mg/L KH2PO4

④MS+1.0 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA

⑤MS+1.0 mg/LIAA+13.5 mg/L KH2PO4+1.5 mg/L 6-BA

按照文獻[7]固體、液體、固液雙層培養方法,于每一種培養基配方下接種6瓶甘草試管苗,每瓶接入5個莖段。將試管苗置于25℃,2 000 lx光照條件下培養,40 d后測量植株全長、株高、根長、根直徑以及稱量試管苗的鮮重。采用精度為0.01 mm的游標卡尺測量根中部直徑為根直徑。其余指標按照常規方法測量或稱量。

2 結果與分析

2.1 不同外源激素水平對甘草試管苗生長的影響

2.1.1 不同外源激素水平對固體培養基中甘草試管苗生長的影響 對固態培養基下甘草試管苗不同性狀的方差分析表明,供試指標全長、株重、根直徑、根長和根重均在①、②、③號培養基中表現較高。與④和⑤中各項生長指標相比,均達到極顯著差異(表1)。說明①、②和③號培養基是甘草試管苗的適宜培養基。從葉片數看,①號培養基的甘草試管苗平均葉片數為8.88片/株,極顯著的高于其他培養基上的葉片數。說明①號培養基最適合于甘草試管苗的生長。

2.1.2 不同外源激素水平對液體培養基下甘草試管苗生長的影響 通過對液態培養方式下試管苗的各項生理指標的方差分析,可得出以下結論,無論是葉片數、株重、根直徑還是根長和根重,①、②、③培養基中表現較好,與④和⑤各項生長指標相比,均達到極顯著差異(表2)。但就全長來說還是以①的值最高,且顯著的高于其他激素配比。因此,在液態培養方式下,生長狀態最好的激素配比仍然是①,在今后的研究中可作參照。

2.1.3 不同外源激素水平對固液雙層培養基下甘草試管苗生長的影響 對固液雙層培養方式下甘草試管苗不同性狀的方差分析表明,試管苗的葉片數、根直徑、根長和根重在①、②、③培養基中無顯著差異。全長和株重在①和②培養基中表現更好。在①培養基中全長和株重的值分別為12.06 cm和0.15 g,在②中的值分別為12.08 cm和0.14 g。而各項生理指標與④和⑤相比,均達到極顯著差異(表3)。由此說明,13.5 mg/L KH2PO4和在此基礎上加有1.0 mg/L IBA的培養基更有利于甘草試管苗的生長及生根。

表1 不同外源激素水平在固態培養方式下對甘草試管苗各性狀的影響Table Representations of licorice seedlings cultured in vitro with solid mediums

表2 不同外源激素水平在液態培養方式下對甘草試管苗各性狀的影響Table 2 Representations of licorice seedlings cultured in vitro with liquid mediums

表3 不同外源激素水平在固液雙層培養方式下對甘草試管苗各性狀的影響Table 3 Representations of licorice seedlings cultured in vitro with combinations of liquid mediums and solid mediums

2.2 不同培養方式對甘草試管苗生長的影響

分別將3種培養方式下,在各個外源激素水平中獲得的各項生理指標的平均值進行對比,分析不同培養方式對甘草試管苗生長的影響。

無論是全長還是根長均以固體培養基下生長的甘草試管苗最好(圖1)。在固體培養基中試管苗全長和根長的平均值分別為10.03 cm和2.65 cm,比液體培養基下的相應指標分別高19.42%和92.97%;比固液雙層下的高28.90%和48.88%。

另外,試管苗根的直徑在固態培養方式下明顯大于液態和固液雙層培養下的甘草根直徑(圖2),其平均直徑0.88 mm,比液體培養基中的值高90.59%,比固液雙層中的值高13.86%。

圖1 不同培養方式對甘草試管苗的全長及根長的影響Fig.1 The length of seedling and root of licorice cultivated in vitro with different culture manners

圖2 不同培養方式對甘草試管苗的根直徑的影響Fig.2 Root diameter of licorice seedling cultivated in vitro with different culture manners

根重和株重也以固態培養基下生長的甘草試管苗最好,其根重和株重的平均值為0.040 g和0.138 g,比液態培養基下的相應指標高71.7%和53.3%。另外,株重平均值比固液雙層培養基下的相應指標高38.0%,但是,根重在固體及固液雙層培養基中無差異(圖 3)。

此外,甘草試管苗葉片數也以固體培養基中的最多,為5.93(片)。分別比液態培養基的多25.4%,比固液雙層培養基的多高18.2%(圖4)。

圖3 不同培養方式對甘草試管苗的根重和株重的影響Fig.3 Fresh root weight and seedling weight of licorice cultivated in vitro with different culture manners

圖4 不同培養方式對甘草試管苗的葉片數的影響Fig.4 The number of leaves of licorice seedling cultivated invitrowith different culture manners

3 討論

通過比較3種不同培養方式下甘草試管苗的生長狀態在固態培養方式下生根及生長狀態最好,加之固體培養方式穩定性好,操作簡便,應為甘草試管苗的最適培養方式,這也證實了Bteat T等[8,9]提出的固體培養方式在生產中是目前使用的甘草組織培養中最常用的培養方式。固液雙層培養雖在根重方面與固態培養間無明顯差別,但其操作繁瑣,藥品浪費較大,而且其余生理指標均不如固態培養方式,所以培養效果應次于固體培養方式。液體培養在3種不同培養方式中甘草試管苗生長狀態最差,而且,其要求操作精細,如在操作過程中一個材料出現污染,將導致全瓶材料的共同污染,從而在以后的甘草試管苗培養方式中不適宜用液體培養。

試驗得到了最適合于甘草試管苗生長的培養基配方(MS+1.0 mg/L IBA+13.5 mg/L KH2PO4)。還發現,培養基中凡加入了KH2PO4的甘草試管苗各指標性狀均表現較好。可能因為P是核酸、細胞質、細胞膜的組成成分,并且在生物體新陳代謝中起著重要的作用。K對參與活體內各種反應的酶起著活化劑的作用,且能促進呼吸進程及核酸和蛋白質的形成[10]。KH2PO4在甘草培養基中增加P和K的含量,可使甘草莖段生根速度快而健壯,而且生根率、種苗移栽成活率均有提高。

試驗中,培養基④、⑤中加入了6-BA的甘草試管苗生長狀態均不佳,不僅沒有形成根,而且在基部產生愈傷組織,并在后期出現褐化,這是由于甘草試管苗難以利用外源6-BA及其代謝中間物,對植株各項生理參數表現出惡化趨勢,謝紹萍[11]在研究甜菊愈傷組織生長分化發現,適當濃度的6-BA能有效地誘導芽的發生,但高濃度則抑制芽的發生。但外源6-BA是如何負面影響植物生長,目前,文獻存在不同的觀點,其機理有待進一步研究。

[1] 杜茜.水分和肥料對甘草產量及品質的影響[J].草原與草坪,2007(5):62-64.

[2] 張繼,姚健,丁蘭,等.甘草的利用研究進展[J].草原與草坪,2000(2):12-17.

[3] 王照蘭,杜建材,于林清,等.甘草的利用價值、研究現狀與存在的問題[J].中國草地,2002,24(1):73-76.

[4] 楊之暢.內蒙古伊克昭盟甘草、麻黃資源的保護和利用問題[J].自然資源,1989(1):70-73.

[5] 楊戈,李銀芳.麥蓋提縣的甘草資源及其保護和利用干早區研究[J].1994,11(3):35-38.

[6] 馮慧敏.遺傳工程在牧草育種方面的研究現狀及展望[J].草原與草坪,1994(2):8-9.

[7] 彭曉莉,王蒂,張金文,等.激素誘導下不同培養方式對馬鈴薯微型薯的誘導效應[J].甘肅農業大學學報,2006,41(1):16-19.

[8] Bteat T,Carle V.Development of an automated plant culture system[J].Plant Cell Tissus and Organ Culture,1985,5(2):107.

[9] Ecluardo H,Kitahhara,Linda S,et al.Shoot and root formation in cells cultures of Eucalyptus[J].Forest Sci,1975,(121):242-243.

[10] 于林清,何茂泰,王照蘭等.甘草組織培養快速繁殖技術研究[J].中國草地,1999(1):12-14.

[11] 謝紹萍,歐陽學智,洪維廉,等.甜菊愈傷組織生長、分化與甜菊苷積累的關系[J].熱帶亞熱帶植物學報,1998,6(1):4-8.