納米氧化銅對(duì)仔豬血漿抗氧化能力的影響

呂文龍，魏 蓉，李 鑫，郭志杰，張德曉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030；2.廣東工業(yè)大學(xué)，廣州 510520）

銅是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一，是體內(nèi)多種酶的組成成分，對(duì)維護(hù)動(dòng)物正常生理機(jī)能至關(guān)重要[1]。畜禽吸收的銅進(jìn)入血液后分布于紅細(xì)胞和血漿中，主要以紅細(xì)胞銅蘭蛋白和血漿銅蘭蛋白的形式存在，而體內(nèi)游離的銅離子會(huì)被快速結(jié)合，構(gòu)成許多金屬酶及金屬蛋白。動(dòng)物體內(nèi)至少有14種含銅酶，如細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome－oxydase）、銅鋅超氧化物岐化酶（CuZn－SOD）、銅藍(lán)蛋白（CP）、單胺氧化酶（MAO）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）等多種酶，參與機(jī)體氧化磷酸化、自由基解毒等代謝過(guò)程[2]。目前常用的銅源主要是硫酸銅與氧化銅，但二者生物利用率低，尤其以促進(jìn)生長(zhǎng)為目的添加高水平銅時(shí)，大量的銅隨糞便排出，污染環(huán)境。在飼料生產(chǎn)和貯存過(guò)程中，Cu2＋極易被還原成Cu，由于大多數(shù)維生素對(duì)銅的催化性十分敏感，這種還原反應(yīng)會(huì)破壞添加劑中的維生素，導(dǎo)致脂肪哈變[3]。原料硫酸銅還易吸水結(jié)塊，腐蝕加工設(shè)備。

納米粒子因其小尺寸、巨大表面積效應(yīng)而呈現(xiàn)出有異于常規(guī)粒子的生物學(xué)功能，納米技術(shù)的發(fā)展為銅的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)研究提供了新的思路[4]。納米微粒易通過(guò)胃腸黏膜，使其透皮吸收的生物利用度得以提高[5]。本試驗(yàn)在仔豬日糧中添加不同劑量納米氧化銅，旨在研究其對(duì)仔豬抗氧化能力的影響，并與硫酸銅和氧化銅進(jìn)行比較，為開(kāi)發(fā)新型高效含銅類飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用杜洛克×約克夏×長(zhǎng)白三元雜交仔豬144頭（購(gòu)自哈爾濱洪福豬場(chǎng)），體重12.58±2.44 kg組內(nèi)、組間差異不顯著（P＞0.05）。隨機(jī)分為6個(gè)處理組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭豬（公母各半）。1組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；2組為硫酸銅組，在基礎(chǔ)日糧中以硫酸銅的形式添加銅 200 mg·kg－1；3組為氧化銅組，在基礎(chǔ)日糧中以氧化銅的形式添加銅 200 mg·kg－1；4～6 組為納米氧化銅組，在基礎(chǔ)日糧中以納米氧化銅的形式分別添加銅5、50、100 mg·kg－1。仔豬從 7 日齡開(kāi)始誘食，28日齡斷奶，預(yù)試期9 d，正試期28 d。

1.2 儀器設(shè)備及藥品試劑

恒溫干燥箱、電子天平、低溫冰箱、低溫超高速離心機(jī)、旋渦混勻器、UV－2100紫外分光光度計(jì)。CuSO4·5H2O、CuO（飼料級(jí)）購(gòu)自哈爾濱希杰飼料有限公司。納米氧化銅（nano－CuO）由浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所提供。

1.3 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧采用玉米－豆粕型基礎(chǔ)日糧。日糧的配制參照美國(guó) NRC（1998）和中國(guó)瘦肉型豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中仔豬營(yíng)養(yǎng)需要配制。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表 1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平 DM

1.4 檢測(cè)方法

試驗(yàn)14、28 d，禁食 12 h，每組固定 4頭仔豬，用一次性注射器經(jīng)前腔靜脈采血 5 mL，凝血后3 000 rpm低溫離心15min，分離血漿樣品，裝于 Eppendorf管中，用于銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn－ SOD）、銅藍(lán)蛋白（CP）、丙二醛（MDA）含量的測(cè)定（檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司）和細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）活性的測(cè)定（檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和LSD多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬銅鋅超氧化物歧化酶活力的影響

不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬銅鋅超氧化物歧化酶活力的影響見(jiàn)表2。

由表 2可見(jiàn)，試驗(yàn)14 d，5組仔豬血漿銅鋅超氧化物歧化酶活力顯著高于 2、3、6組（P＜0.05），其他各組差異不顯著（P＞0.05），試驗(yàn) 28 d，1、2組仔豬血漿銅鋅超氧化物歧化酶活力顯著高于 4、5、6組（P＜0.05），3組與 4、6組差異不顯著。

表2 納米氧化銅對(duì)仔豬CuZn-SOD活性的影響U·m L－1

2.2 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿銅藍(lán)蛋白活力的影響

不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿銅藍(lán)蛋白活力的影響見(jiàn)表3。由表 3可見(jiàn)，試驗(yàn) 14 d，5、6組仔豬血漿銅藍(lán)蛋白活力顯著高于其他各組（P＜0.05），2、4 組顯著高于 1、3 組（P＜0.05）；試驗(yàn)28 d，5、6組仔豬血漿銅藍(lán)蛋白活力顯著高于其他各組（P＜0.05），4組顯著高于 1、3 組（P＜0.05）。

表3 納米氧化銅對(duì)仔豬CP活力的影響U·L－1

2.3 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿細(xì)胞色素C氧化酶活性的影響

不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿細(xì)胞色素C氧化酶活性的影響見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，試驗(yàn)至14 d，5、6組仔豬血漿細(xì)胞色素 C氧化酶活性顯著高于 1、2、3組（P＜0.05），2、4 組顯著高于 1、3 組（P＜0.05）；試驗(yàn)至28 d，5、6組仔豬血漿細(xì)胞色素C氧化酶活性顯著高于 1、3組（P＜0.05），2、4組顯著高于 1組（P＜0.05）。

表4 納米氧化銅對(duì)仔豬血漿CCO活性的影響 U·L－1

2.4 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿丙二醛含量的影響

不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿丙二醛含量的影響見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，試驗(yàn)14 d，5組仔豬血漿丙二醛含量顯著低于 1、6組（P＜0.05），其他各組差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn) 28 d，2、4、5 組仔豬血漿丙二醛含量顯著低于 1、3、6組（P＜0.05）。

表5 納米氧化銅對(duì)仔豬血漿MDA含量的影響 nmol·m L－1

3 討論

3.1 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿銅鋅超氧化物歧化酶活力的影響

CuZn－SOD是體內(nèi)主要存在的一種金屬抗氧化酶，在生物體內(nèi)對(duì)抗氧化、解毒等起重要作用，且有抗輻射、抗腫瘤及抗衰老等功能。銅作為銅鋅超氧化物歧化酶的金屬輔酶，是CuZn－SOD的活性中心、輔助因子和調(diào)節(jié)因子，在維護(hù)其結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用[6－7]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)大鼠日糧缺銅時(shí)，其肝臟中CuZn－SOD活性顯著下降[8]。張?zhí)K江等報(bào)道，低劑量的銅能使豬血清 CuZn－SOD活性提高[9]。研究表明，產(chǎn)蛋雞日糧中添加硫酸銅30mg·kg－1時(shí)，CuZn－SOD 活性明顯高于添加硫酸銅 0、6、15、60、125 mg·kg－1組[10]。本試驗(yàn)日糧中添加納米氧化銅 100 mg·kg－1可顯著提高 CuZn－SOD活性，說(shuō)明納米氧化銅可以起到增強(qiáng)仔豬機(jī)體抗氧化的功能，而200 mg·kg－1劑量則顯著降低了 CuZn－SOD活性，這可能因?yàn)樵?CuZn－SOD活性中心，Cu不可代替，Zn可被多種元素代替。高劑量的銅可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Zn的吸收，缺少Zn的CuZn－SOD的活性下降。

3.2 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿銅藍(lán)蛋白活力的影響

CP具有抗氧化性，能強(qiáng)有力地抑制脂類自身氧化，清除體內(nèi)自由基的蛋白，具有類似銅鋅超氧化物歧化酶的作用。CP主要由肝臟合成，然后隨血液循環(huán)在身體各處發(fā)揮作用。許多研究證實(shí)，銅可提高銅藍(lán)蛋白的活性。崔偉等研究表明，日糧添加硫酸銅 200 mg·kg－1可使天府肉鴨血漿中 CP的活性顯著升高，但日糧中銅含量超過(guò) 400 mg·kg－1時(shí)血漿 CP活性與日糧銅水平呈現(xiàn)強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)[11]。王艷華研究結(jié)果顯示，日糧中添加納米銅5、60 mg·kg－1可使仔豬肝臟中 SOD活性提高 139.05%、285.03[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加納米氧化銅組仔豬血漿銅藍(lán)蛋白活力顯著高于其他各組。

3.3 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿CCO氧化酶活性的影響

CCO存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，是真核生物線粒體內(nèi)膜和需氧菌細(xì)胞膜電子傳遞鏈上的終端酶，主要通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，納米氧化銅能顯著提高仔豬血漿細(xì)胞色素C氧化酶的活性。

3.4 不同劑量的納米氧化銅對(duì)仔豬血漿丙二醛含量的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA對(duì)線粒體呼吸功能、丙酮酸脫氫酶α－酮戊二酸脫氫酶等具有顯著的抑制作用。MDA的含量能反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，反映細(xì)胞損傷程度。研究表明，在日糧中添加硫酸銅30mg·kg－1，可使產(chǎn)蛋雞血漿總抗氧化能力明顯升高，血漿中丙二醛含量顯著降低。崔偉等研究結(jié)果表明，當(dāng)日糧銅水平超過(guò)200 mg·kg－1時(shí)，天府肉鴨血漿 MDA含量顯著升高[11]。本試驗(yàn)通過(guò)添加不同劑量的納米氧化銅，結(jié)果顯示，試驗(yàn)至14 d，5組仔豬血漿丙二醛含量顯著低于 1、6組；添加納米氧化銅能顯著降低MDA含量；而添加高納米氧化銅顯著提高了MDA含量，這可能是由于高銅日糧使得血漿的 CuZn－SOD和血漿的CP活性降低，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的清除能力降低，從而導(dǎo)致血漿中MDA含量的升高。

4 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)日糧中添加納米氧化銅50 mg·kg－1能顯著提高仔豬血漿銅鋅超氧化物歧化酶活性、銅藍(lán)蛋白活力、細(xì)胞色素C氧化酶的活性，降低血漿丙二醛含量。

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