枯草芽孢桿菌所產細菌素的理化性質及抑菌譜的研究

徐海燕，張志焱，曹銀生，李美麗，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

近年來，由于抗生素的濫用，在食品中抗生素、藥物殘留及防腐劑添加超標而導致的出口損失，已成為畜牧業發展的瓶頸。人們迫切需要探尋一種能取代抗生素的抗菌劑，于是細菌素成為近年來研究的熱點。

細菌素是細菌代謝過程產生的蛋白質或多肽，具有抑制某些微生物生長活性的作用[1-2]。細菌素是一種蛋白類物質，可以被蛋白酶所降解，具有無抗藥性、無殘留、能夠抑制或殺死某些致病菌等優點[3-4]。

枯草芽孢桿菌作為公認的益生菌，其產生的細菌素在養殖業和畜牧業中作為綠色飼料添加劑使用有著巨大的開發潛力。為此，本文初步分析了枯草芽孢桿菌Nxc6所產細菌素的理化性質及其抑菌譜，以期為該細菌素在養殖業和其他領域的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

枯草芽孢桿菌Nxc6由山東寶來利來生物研究院從牛糞中分離，經數次傳代，抗菌活性穩定。

指示菌：大腸桿菌O1、金黃色葡萄球菌等，由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物研究院保存。

1.2 培養基

細菌指示菌培養基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、進口瓊脂1.5%、pH 7.0。

真菌指示菌培養基：PDA培養基。

枯草芽孢桿菌Nxc6種子培養基：肉湯培養基。

枯草芽孢桿菌Nxc6發酵培養基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、pH 6.5。

1.3 芽孢桿菌發酵液的制備

從枯草芽孢桿菌Nxc6斜面上挑取一環至液體種子培養基中，37℃振蕩培養24 h，然后以1%的接種量接種到發酵培養基中，置500 mL三角瓶中，裝液量為100mL，37℃振蕩培養30 h，得到發酵液，待用。

1.4 產細菌素的鑒定

將發酵液3 000 rpm離心15 min，去除菌體得上清液，首先測定上清液中pH的變化，排除酸的影響，采用過氧化氫酶法進行過氧化氫的檢測，以排除過氧化氫的干擾。然后緩慢的向上清液中加入終質量分數為60%的硫酸銨進行鹽析，4℃放置12 h使蛋白質充分沉淀，5 000 rpm離心20 min，棄上清，將沉淀溶于原體積1/10的蒸餾水中，制成抗菌液，進行抗菌活性的測定。

1.5 最佳硫酸銨濃度的選擇

將培養好的發酵液于3 000 rpm離心15min去除菌體，上清液倒入8個250mL三角瓶中，每瓶100 mL，邊攪拌邊緩慢加入經過研磨的無水硫酸銨粉末，使溶液的最終質量分數分別達到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，4℃放置8～12 h，使蛋白沉淀出來，13 500 rpm離心10min，棄上清，用蒸餾水將沉淀復溶，倒入透析袋中進行流水透析（過夜）；分別測定8個濃度的上清液和透析液的抗菌活性，根據抑菌圈的大小確定硫酸銨的最佳質量分數。

1.6 細菌素抗菌活性的檢測

細菌素抗菌活性的檢測采用牛津杯法。雙碟的制備：取直徑90 mm的培養皿，注入滅菌的營養瓊脂（1.5%）15mL，水平放置使之凝固，作為底層，取指示菌培養基（濃度為0.8%，冷卻至50℃）與指示菌菌液適量混勻，取6 mL鋪在底層培養基上，水平放置使之凝固，作為菌層。

用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，打開皿蓋，放在培養基上。在牛津杯中加滿相同量的抗菌液（300μL），每個樣品3個重復。將加完樣的培養皿小心放入37℃恒溫箱內，培養18 h后（其中以真菌做指示菌的培養時間為30℃、3 d）取出測量抑菌圈直徑。

1.7 枯草芽孢桿菌Nxc6抗菌蛋白粗提液的性質研究

溫度穩定性：分別取5mL透析液于9支試管中，在20、40、60、80和100℃ 下處理 10、30和60min，冷卻后檢測其抗菌活性。

pH的穩定性：分別取5 mL透析液于8支試管中，用 4mol·L－1的鹽酸或 4mol·L－1的氫氧化鈉溶液將發酵上清液pH調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，室溫下保持24 h后將各管的pH調回7.5，檢測其抗菌活性。

蛋白酶穩定性：將透析液分別與胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶混合，使酶的終濃度為0.5 mg·mL－1，在各種酶的最適溫度、最適pH下作用2 h，反應結束后將混合液的pH調回7.5，檢測其抗菌活性。

1.8 抑菌譜的測定

抗細菌活性試驗采用牛津杯法，同1.6。

孢子懸液的制備：向培養好的真菌斜面上注入5 mL無菌生理鹽水，洗下孢子制成菌懸液（含107孢子·mL－1）。雙碟的制備以及加樣品同1.6，其中菌層指示菌為真菌孢子懸液。

2 結果

2.1 產細菌素的鑒定

微生物發酵后能夠產生多種抗菌物質，如：脂肪酸、氨等，枯草芽孢桿菌Nxc6經發酵后，其發酵液的pH為7.5，故可排除酸堿抗菌的影響，并且其上清液有明顯的抑菌活性。其上清液經硫酸銨沉淀后表現出更加明顯的抗菌活性，見表1。

因此，可以認為枯草芽孢桿菌Nxc6所表現出來的抗菌活性主要是蛋白類物質，即細菌素類物質。

表1 產細菌素的鑒定mm

2.2 最佳硫酸銨質量分數的確定

不同硫酸銨質量分數沉淀結果（以抑菌圈直徑表示）見表2。

表2 不同硫酸銨質量分數沉淀結果 mm

從表2可以看出，硫酸銨的質量分數在20%～40%時，透析液的抑菌活性處于較高的平臺期，這一階段是比較穩定的，并且硫酸銨質量分數為30%時上清液的抑菌活性處于較低的水平，說明細菌素的分離是比較完全的。雖然質量分數為70%時硫酸銨沉淀出的細菌素與硫酸銨質量分數為30%沉淀產生的細菌素的抗菌活性大體相同，但是進一步增加硫酸銨的濃度，只能析出雜蛋白，對抗菌活性無顯著的影響，因此硫酸銨沉淀的最終質量分數為30%。

2.3 枯草芽孢桿菌Nxc6抗菌蛋白粗提液的性質研究

2.3.1 溫度穩定性

不同溫度和處理時間對細菌素活性的影響結果見圖1。

圖1 不同溫度和處理時間對細菌素活性的影響

從圖1可以看出，枯草芽孢桿菌Nxc6所產生的細菌素具有良好的熱穩定性。對金黃色葡萄球菌而言，在20、40、60、100℃處理30min，活性基本沒什么變化，只是在80℃處理60min時，活性出現了小幅的下降。對大腸桿菌而言，在20、40、60、100℃處理10min，活性沒有較大的波動，只是在80℃處理30～60 min時，活性出現了小幅的下降。枯草芽孢桿菌Nxc6所產細菌素的這種熱穩定性為其工業化生產和應用提供了理論依據。

2.3.2 pH的穩定性

不同pH對細菌素活性的影響結果見圖2。

圖2 不同pH對細菌素活性的影響

從圖2可以看出，對金黃色葡萄球菌而言，pH為10.0～11.0時的抗菌活性下降較為明顯，但仍保持在較高的水平；對大腸桿菌O1而言，pH為11.0時的抗菌活性稍有下降。可見枯草芽孢桿菌Nxc6產生的細菌素在弱酸、中性以及堿性環境中有很好的穩定性。

2.3.3 蛋白酶穩定性

蛋白酶對抗菌物質活性的影響結果見圖3。

圖3 蛋白酶對抗菌物質活性的影響

從圖3可以看出，枯草芽孢桿菌Nxc6發酵上清液經過幾種蛋白酶處理后，抗菌活性明顯降低，但仍具有一定的活性，尤其是對胰蛋白酶最為敏感，這一結果表明了該細菌素是蛋白類物質。

2.4 細菌素的抑菌譜測定

2.4.1 細菌素對各種細菌的抑菌譜

細菌素對各種細菌的抑菌譜結果見表3。由表3可知，該細菌素對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯的抑制作用，表明其是一種比較廣譜抗菌的細菌素。

表3 細菌素對各種細菌的抑制作用 mm

2.4.2 細菌素對各種真菌的抑菌譜

細菌素對各種細菌的抑制作用結果見表4。

由表4可知，該細菌素對部分真菌有較強的抑制作用，而對部分真菌則無抑制作用。

表4 細菌素對各種細菌的抑制作用mm

3 結論

研究表明，枯草芽孢桿菌Nxc6所產細菌素具有較強的抑菌效果，且具有很好的熱穩定性、酸堿穩定性，在pH為8.0時抑菌活性最大，胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶均可使該細菌素部分失活。

枯草芽孢桿菌Nxc6所產細菌素的抑菌譜較寬，對畜牧業及食品污染中常見的致病微生物金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及對引起農作物患病的腐敗菌（如白葉枯病菌）有明顯的抑制作用，因此枯草芽孢桿菌Nxc6所產細菌素在畜牧業、養殖業以及食品、農業等領域中具有一定的應用價值。

[1]李平蘭,張篪,江漢湖.細菌素研究慨述[J].中國畜產與食品,1998,5（2）:82-84.

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[3]劉煥利,潘小玫,張學君,等.產抗菌蛋白芽孢桿菌的篩選及抗菌蛋白性質[J].中國生物防治,1995,11（2）:160-164.

[4]周冰,張惟材.枯草芽孢桿菌蛋白質分泌機制研究進展[J].生物技術通訊,2004,15（3）:281-285.