胃癌中PTEN和hTERT的表達及意義

馬鵬 談曉紅 馮義朝

張力蛋白同源、第10染色體丟失的磷酸酶基因 (phosphatase and tension homology deletedon chromosome ten, PTEN)，是目前發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，參與細胞凋亡調(diào)控[1]，近年研究發(fā)現(xiàn)，其表達與一些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學行為和預后有密切的關(guān)系[2]。近年來研究表明，端粒酶的激活及其活性上調(diào)是惡性腫瘤發(fā)病機制中極其重要和關(guān)鍵的一步，其活性高低主要取決于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTER)的表達水平，hTER為端粒酶活性的限速因子[3]。我們應用免疫組化技術(shù)研究PTEN和hTER蛋白表達與胃癌及癌前期病變的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 2003年～2005年我院普外科術(shù)后胃癌大體標本80例，術(shù)前均未化放療，男56例，女24例。年齡23歲～72歲(平均54歲)。經(jīng)蘇木素伊紅染色，病理醫(yī)生診斷。兔抗人hTERT多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)公司，PTEN單克隆抗體(濃縮液)、(S～P)試劑盒及(DAB)購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 每個病例病理切片均分二部分，分別檢測PTEN和hTERT蛋白的表達情況。標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚的石蠟切片65℃烘烤，脫蠟，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復抗原，10%正常山羊血清封閉，hTERT多克隆抗體及PTEN單克隆抗體(1:50) 4℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加生物素標記抗人IgG藥置于室溫下30分鐘，沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素室溫下孵育30分鐘，沖洗后DAB顯色，蘇木素染色，封片。光鏡觀察。用已知陽性胃癌切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 PTEN染色定位在細胞質(zhì)內(nèi)，hTERT陽性染色主要定位于細胞核，呈棕黃色，以細胞質(zhì)或細胞核呈棕黃色顆粒為陽性。由兩位病理科醫(yī)師隨機選擇5個有代表性的視野計數(shù)200個細胞，按陽性細胞占同類記數(shù)細胞的百分比將免疫組化結(jié)果分為陰性，即百分比＜10%；陽性即百分比＞10%。實驗結(jié)果拍攝成像。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，采用x2檢驗對免疫組化結(jié)果進行分析處理，以P＜0.05為差異具有顯著意義。

2 結(jié)果

所檢測的80例胃癌中，早期胃癌29例，PTEN表達率為62.1%，hTERT表達率為65.5%，中晚期胃癌51例，PTEN表達率為37.3%。hTERT表達率為96.1%。詳見表2。

PTEN和hTERT在胃癌中的相關(guān)性:80例胃癌組織中PTEN和htert蛋白表達強度呈明顯負相關(guān)(P＜0.05)，即胃癌組織中hTERT表達愈強，pten蛋白表達就愈弱，反之亦然，詳見表1，表2，表3。

3 討論

張力蛋白同源、第10染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)作為一種抑癌基因，其表達的蛋白具有雙磷酸酶活性，可以通過脫磷酸作用調(diào)節(jié)多種信號傳導系統(tǒng)，包括下調(diào)黏著斑激酶(FAK)的活性抑制細胞的黏附，浸潤和轉(zhuǎn)移[4]，通過磷酸肌醇(PI3K)途徑促進細胞的凋亡，抑制細胞的增殖，通過促分裂原活化蛋白(MAPK)途徑抑制細胞的分化。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，廣泛存在于永生化細胞和腫瘤細胞中，人端粒酶包括三個主要部分:即人端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(TP1)和端粒酶催化亞單位，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT，hEst2)。端粒酶的主要功能是以自身RNA為模板，從頭合成端粒，維持染色體末端穩(wěn)定，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。多項研究報道，hTERT基因與端粒酶活性具有密切的相關(guān)性。hTERT對端粒酶活性表達起限速作用，其主要功能是具有逆轉(zhuǎn)錄活性。

胃癌是常見的消化道腫瘤，在胃癌的發(fā)生中，從正常胃黏膜上皮轉(zhuǎn)化成癌是一個多步驟的過程，是由于多種基因異常在多年的階段中積累的結(jié)果，其中涉及到多種癌基因，抑癌基因，端粒及端粒酶，細胞黏附因子及DNA錯配修復基因的異常和積累，本結(jié)果表明，在從慢性胃炎-萎縮性胃炎—腸上皮化生-異型性增生-癌變的過程中，PTEN的陽性表達率逐漸降低，缺失率逐漸升高，hTERT陽性表達逐漸升高。PTEN蛋白在異型性增生組PTEN表達率為63.3%較萎縮性胃炎伴腸化明顯減低，且有顯著差異(P＜0.05)，說明隨著增生程度的增加，抑癌基因的缺失也越來越明顯。抑癌基因PTEN對于增生性萎縮性胃炎向異型性增生以及惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。本研究結(jié)果還表明，在本組胃癌組織中PTEN的陽性表達率為46.3%,與患者的年齡，性別無關(guān)(P＞0.05)。PTEN的陽性表達在與腫瘤的大小顯著相關(guān)(P＜0.01)，在進展期胃癌中的表達明顯低于早期胃癌且有顯著差異(P＜0.05)，在有淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌表達明顯低于無淋巴轉(zhuǎn)移的且有顯著差異(P＜0.05)，PTEN在低分化胃癌的表達率低于高分化胃癌且有顯著差異(P＜0.01)，說明隨著腫瘤惡性程度的增加，PTEN的缺失率增高,也說明PTEN表達缺失貫穿與胃癌的整個發(fā)展過程中。PTEN蛋白表達降低，使癌細胞增殖速度增快，對凋亡信號的敏感性降低，腫瘤生長速度增快，故PTEN的表達與腫瘤的大小有密切的相關(guān)性。PTEN可以使FAK脫磷酸，從而阻止整合素介導的細胞擴散和轉(zhuǎn)移，故PTEN表達低的組，胃癌有較高的轉(zhuǎn)移率。本組實驗結(jié)果顯示，在80例胃癌組織中，hTERT陽性表達85%，明顯高于正常對照組0.0%及癌前病變(PL)組53.3%，差異有顯著性(P＜0.001)，說明hTERT表達與胃癌的發(fā)生有關(guān)；實驗還結(jié)果顯示，胃癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組hTERT陽性率為91.7%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組70.59%，差異有顯著性(P＜0.05)。提示hTERT陽性表達可能是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標；說明hTERT表達上調(diào)對于胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能起重要作用。檢測hTERT，可能有助于胃癌的預后判斷。提示hTERT有可能成為胃癌診斷的敏感而特異的一個新的腫瘤分子標志物。

表1 不同胃粘膜組織中hTERT和 PTEN陽性表達

表2 胃癌病人hTERT、PTEN表達與臨床病理特征指標關(guān)系

表3 胃癌組織hTERT活性表達與PTEN表達的關(guān)系

總之，抑癌基因PTEN的失活和端粒酶激活是胃癌變的早期表現(xiàn)，貫穿于胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中。胃癌組織中PTEN和hTERT蛋白表達呈負相關(guān)，PTEN蛋白的表達越弱，hTERT蛋白的表達就越強,提示胃癌組織中hTERT的蛋白激活與PTEN蛋白的低表達和失表達密切相關(guān)，從而說明胃癌中PTEN蛋白的表達減低可能在胃癌中的hTERT活化起著調(diào)控作用，使細胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖，導致胃癌的發(fā)生。提示聯(lián)合檢測PTEN和hTERT達蛋白表達可作為判定胃癌生物學行為的客觀指標。

[1] Maurice-Duelli A,Ndoye A,Bouali S,et al.Enhanced cell growth inhibition following PTEN nonviral gene transfer using polyethylenimine and photochemical internalization in endometrial cancer cells[J].Technol Cancer Res Treat,2004,(5)3:459-466.

[2] Khan S,Kumagai T,Vora J,et al.PTEN promoter is methylated in a proportion of invasive breast cancers[J].Int J Cancer 2004,(3)112:407-408.

[3] 林 云,涂亞庭,鄭方蓉,等.尖銳濕疣和外陰鱗狀細胞癌中htert mrna和survivin的表達及其相互關(guān)系[J].中國麻風皮膚病雜志,2006,22(3):179-81.

[4] Amura M,CU J,Tran H,et al PTEN gene and integrin signaling in cancer[J].Natl cancer Inst,1999,91(21):1820-1828.