枯草芽孢桿菌對草魚生長性能與腸道黏膜形態的影響

蘇州大學基礎醫學與生物科學學院 邱 燕 蔡春芳 代小芳 葉元土＊ 尹曉靜 張 俊 譚芳芳

隨著水產養殖業的發展和抗生素的廣泛應用，抗生素的缺點逐漸暴露出來，抗生素濫用不但起不到防病增產的目的，反而造成動物腸道內致病菌的抗藥性以及水產品中的藥物殘留問題，進而影響人類的身體健康。微生態制劑作為可替代抗生素的一種飼料添加劑已經引起人們的廣泛重視（Hwang等，2008）。其中，枯草芽孢桿菌以其抗菌性能好、穩定性強及對水產動物的益生作用受到廣大研究者的青睞。本試驗旨在探討枯草芽孢桿菌對草魚生長性能的影響，為枯草芽孢桿菌在草魚飼料中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 芽孢桿菌屬：枯草芽孢桿菌，活菌數達到2.0×109CFU/g。草魚：由無錫宜興養殖廠提供，平均體重（69.51±6.29）g，共 240 尾。

1.2 試驗設計及日糧組成 試驗草魚隨機分為5組，以基礎飼料作為對照組；在基礎飼料中分別添加 1000、1500、2000 mg/kg 和 2500 mg/kg 的枯草芽孢桿菌作為4個試驗組，共5個組。每組3個重復，每個重復16尾魚，基礎日糧組成及營養水平見表1。飼料原料經微粉碎后過40目篩，混合均勻后用小型顆粒飼料機加工成直徑1.5 mm的顆粒飼料備用，飼料加工過程中溫度65～70℃，持續時間約1 min。

表1 基礎日糧組成及營養水平（干物質基礎）

1.3 飼養管理 在50畝的池塘中設置網箱進行養殖試驗，網箱規格為1 m×1 m×1.5 m，本試驗共15個網箱。試驗魚經過2周的養殖馴化后再進行分組。飼料投喂每天3次，投喂量為體重的2%～3%。試驗時間為2008年8～10月，飼養期間水質條件為：水溫（28.0 ± 3.0）℃，DO ＞ 8.0 mg/L，pH＜8.3，亞硝酸鹽＜0.01 mg/L，硫化物＜0.05 mg/L。正試期70 d。

1.4 樣品采集和分析 飼養試驗結束后，禁食24 h后測定每箱魚的總體重和尾數，計算成活率、飼料系數、特定生長率。解剖試驗魚，取出內臟團，分離出腸道，剔除表面脂肪組織，分別取中腸1 cm左右的組織1～2塊，縱向剖開，使腸黏膜暴露于空氣中，用生理鹽水沖洗3～4次，除去其上所帶有的血液、糞便等雜質，制得腸道樣品。

掃描電鏡腸道樣品置于4%戊二醛固定液中，超聲波洗滌10 min，更換固定液再次洗滌，更換固定液保存。制樣時將其取出，洗滌，適當修剪，1%鋨酸固定1 h，0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液洗3次，叔丁醇系列梯度脫水，真空干燥，噴金，S-4700型冷場發射掃描電鏡觀察、拍照。

組織切片腸道樣品置于4%中性甲醛中固定、70%乙醇保存。分別經濃度為70%、80%、90%、95%以及100%的酒精梯度脫水，并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔點石蠟中。使用KD-2508型切片機橫向連續切片，厚度為8 μm，而后展片于清潔的載玻片上。采用H.E染色，中性樹膠封片。顯微測量腸道皺襞高度、寬度，黏膜層、肌層、漿膜層厚度，光學顯微鏡下觀察并采用Nikon COOLPIX4500型相機進行拍照。

1.5 計算公式

成活率/%＝（試驗末魚尾數/試驗初魚尾數）×100；

特定生長率/（%/d）＝（ln 末均重－ln 初均重）/飼養天數×100；

飼料系數＝每個網箱投喂飼料總量/每個網箱魚體總增重量。

1.6 數據處理 采用Excel進行數據處理，采用SPSS 14.0版統計軟件中One-Way ANOVA過程進行方差分析，并進行Duncan’s多重比較，顯著水平為0.05，試驗數據用“平均數±標準差”表示。

2 結果

2.1 枯草芽孢桿菌對草魚生長性能的影響 見表2。各試驗組成活率均為100%，對照組為98%。在特定生長率方面：與對照組相比，各試驗組分別增加了 12.77%、22.34%、30.85%和5.32%；其中，枯草芽孢桿菌以2000 mg/kg組顯著高于對照組（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。在飼料系數方面：與對照組相比，各試驗組分別下降了16.46%、26.16%、31.22%、5.06%，其中2000 mg/kg組顯著低于對照組（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P ＞0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌對草魚腸道黏膜形態的影響

2.2.1 腸道皺襞觀察 結果見表3，各試驗組均高于對照組，其中1500 mg/kg和2500 mg/kg組顯著高于對照組（P＜0.05）；黏膜層厚度與皺襞高度表現一致。各試驗組皺襞寬度、肌層厚度、漿膜層厚度均與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 腸道微絨毛觀察 結果見表4，除1500 mg/kg組外，其余試驗組微絨毛高度均高于對照組，其中1000 mg/kg和2500 mg/kg組顯著高于對照組（P＜0.05）。各試驗組微絨毛寬度均顯著高于對照組（P＜0.05），微絨毛密度均高于對照組（P＞0.05）。

表2 枯草芽孢桿菌對草魚成活率、特定生長率和飼料系數的影響

表3 枯草芽孢桿菌對草魚腸道皺襞的影響μm

表4 枯草芽孢桿菌對草魚腸道微絨毛的影響

3 討論

本試驗結果表明，枯草芽孢桿菌具有顯著提高草魚生長性能的作用。各試驗組草魚特定生長率均比對照組增加5%以上，其中2000 mg/kg組顯著高于對照組，增加了30.85%；各試驗組飼料系數與對照組相比，下降了5%以上，其中2000 mg/kg組顯著低于對照組，下降了31.22%。這與劉云高（1994）、王子彥等（1994）報道結果一致。

本試驗各試驗組腸道皺襞高度均高于對照組，其中1500 mg/kg和2500 mg/kg組皺襞高度顯著高于對照組。腸道皺襞的高度增加，能夠增大腸內表面積從而使腸道的吸收面積、腸道與食物的接觸面積增大，因而消化功能增強。

微絨毛是腸道的特有結構，它的高矮和密度大小直接影響腸道的吸收面積。馬力等（1989）研究表明，腸黏膜上皮游離端紋狀緣（微絨毛）含有多種消化酶，具有消化吸收的雙重作用。本試驗通過對草魚腸道掃描電鏡的觀察可知，各試驗組微絨毛高度均高于對照組，其中1000 mg/kg和2500 mg/kg組顯著高于對照組，各試驗組微絨毛寬度均顯著高于對照組，各試驗組微絨毛密度均高于對照組，表明枯草芽孢桿菌能夠促進草魚腸道微絨毛的生長發育，通過顯著增加微絨毛高度、寬度，并增加其密度來增加腸道的吸收面積，增強腸道的消化吸收能力，提高飼料利用率，從而促進草魚的生長。

本試驗枯草芽孢桿菌添加到2500 mg/kg，特定生長率有下降的趨勢且飼料系數有所增加，可能由于過量添加枯草芽孢桿菌導致魚體內菌群比例失調，生產性能下降。此外，芽孢桿菌產生過量的酶也有可能抑制動物體內內源酶的活性，降低內源酶對營養物質的分解作用，從而降低了生長性能，這與王愛民（2003）、劉迎春（1996）報道在魚類飼料中添加一定的外源酶能促進魚體生長，過量的外源酶降低魚體的生長性能的研究結果相似。

4 結論

適量添加枯草芽孢桿菌能夠通過改善草魚腸道黏膜形態，促進草魚對營養物質的吸收利用，從而促進草魚生長。

[1]劉云高，楊明高，胡未一，等.魚用微生物飼料添加劑（8801）對鯉魚促生長試驗[J].四川農業大學學報，1994，增刊：650～653.

[2]劉迎春.飼用復合酶對產蛋雞低蛋白飼糧氨基酸可利用率的影響：[碩士學位論文][D].南京：南京農業大學，1996.

[3] 馬力.掃描電鏡研究露斯塔野紋的腸粘膜[J].水產學報，1989，13（2）：177～180.

[4]王愛民.外源酶對內源酶活性、腸道組織及生產性能的影響研究：[碩士學位論文][D].南京：南京農業大學，2003.

[5]王子彥，何明清，陳孝躍，等.魚用微生物飼料添加劑在不同營養水平下對魚的促生長研究[J].四川農業大學學報，1994，增刊：658～661.

[6]HwangM H，Kim M H，GebruE，etal.Killing rate curve and combination effects of surfactin C produced from bacillus subtillus complex BC1212 against pathogenic Mycoplasma hyopneumoniae[J].World J Microbi Biot，2008，5：9749 ～ 9752.