應用全骨髓貼壁法獲取高純度大鼠骨髓間充質干細胞的實驗研究

盧 寧, 趙龍鳳, 李 紅, 郝彥琴, 黃麗麗 (山西醫科大學第一臨床醫學院感染科, 太原 030001; 通訊作者,Tel:0351-4639004)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其具有強大的多向分化潛能及自我更新能力,且由于其易于分離培養擴增的特性而日益受到關注[1-3]。但骨髓中的間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)含量極低,每 10萬個單個核細胞中大約只有 1個 MSC[3]。因而,本實驗旨在探討適宜的方法在體外獲得大量優質的 BMSCs,以使其更好地服務于基礎及臨床研究。

圖4 BMSCs表型的免疫細胞化學染色 (×400)Fig 4 Immunocytochem istry of phenotype of BMSCs(×400)

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 清潔級健康雄性 Wistar大鼠(山西醫科大學實驗動物中心提供)。實驗試劑:DMEM-F12培養基(美國 Hyclone公司);胎牛血清(中國杭州四季青生物公司);胰蛋白酶(美國 sigma公司);兔抗大鼠 CD34、CD44、CD45(中國北京博奧森公司);3110型 CO2恒溫培養箱(美國 Thermo公司);CKX41型倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS);SWCJ-IFD超凈工作臺(中國蘇凈集團安康公司);KDC-40低速離心機(中國科大創新股份有限公司中佳分公司);流式細胞儀(美國 Becton Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的體外分離及原代培養 取清潔級健康雄性 Wistar大鼠,體重約 150 g,脫臼處死。首先用 75%酒精浸泡消毒 5min,然后用已提前消毒的手術器械無菌分離四肢長骨,去除骨膜及殘留肌肉,剪去長骨兩端,暴露髓腔后用注射器吸取 DMEM液反復沖洗骨髓腔,收集沖洗液,離心(1 200 r/min,共 10min),棄上清。用含 20%胎牛血清的 DMEMF12培養基反復吹打重懸細胞,制成單細胞懸液,計數后以 1×109/ml密度接種于培養瓶(25 cm2),標記為 P0,置于 37℃、5%CO2孵箱內,旋開半檔瓶蓋培養。24 h后進行半量換液,以后每 2-3 d換液,棄去未貼壁細胞以達到純化的目的,當貼壁細胞長到 80%融合時結束原代培養。……