食管癌引流區淋巴結細胞裸鼠體內抑瘤實驗

國建飛,楊立偉,高志明,何 明,白世祥,施 靖

腫瘤的細胞過繼免疫治療日益受到重視。成熟的樹突狀細胞 (dendritic cell,DC)是體內功能最強的、最有效的抗原遞呈細胞。腫瘤引流區淋巴結 (tumor-draining lymph node,TDLN)含有豐富的淋巴細胞,由于其特殊的位置,又含有較多的已攝取腫瘤抗原的樹突狀細胞,TDLN可以成為一種較好獲得的對腫瘤細胞有很強殺傷作用的淋巴細胞潛在來源。本研究通過建立人食管癌裸鼠模型,探索 TDLN在體內對食管癌細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級 BALB/C裸鼠 30只,3～4周齡,體質量 14～17 g,雄性,購于中國醫學科學院動物中心,實驗動物質量合格證明號是 48678。飼養室內恒溫、恒濕,定期紫外線照射,鼠籠、墊料、飲水、飼料均高壓消毒。

1.1.2 腫瘤標本 取自河北醫科大學第四醫院胸二科食管中段癌手術患者,男性,65歲。臨床病理分期:T3N1M0,中分化鱗狀細胞癌。術前未行放、化療。

1.1.3 TDLN細胞 術中取同一患者 TDLN制成細胞懸液培養7 d獲得。

1.2 方法

1.2.1 TDLN細胞的培養和食管癌細胞抗原的制備 手術時無菌摘取2～3個無明顯轉移的淋巴結,用 D-Hank′s液沖洗并去除結締組織和脂肪組織后,剪成 1mm3大小的組織碎片,200目鋼網過濾,懸于 30m lRPMI1640培養基。將 TDLN細胞分為 3組進行培養,TDLN-Ⅰ組培養基中添加 IL-2,TDLN-Ⅱ組添加 IL-2+IL-4+粒 -單核細胞集落刺激因子 (GM-CSF),TDLN-Ⅲ組添加 IL-2+IL-4+GM-CSF+自身食管癌細胞抗原 (tAg),置于 37℃,5%二氧化碳 (CO2)培養箱培養,具體方法參見文獻 [1]。

1.2.2 人食管癌裸鼠移植瘤模型的建立 手術時無菌切取部分食管癌組織塊,用 0.9%氯化鈉注射液沖洗后切成近 1 mm3大小,植入裸鼠腋背部皮下,具體方法參照文獻 [2]。

1.2.3 動物模型的分組及處理 依移植瘤體積大小編號,采用隨機數字表法將動物模型分成 5組:空白對照組、IL-2組、TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組、TDLN-Ⅲ組,每組 6只裸鼠。1周后治療 (瘤體大約 30 mm3,淋巴結細胞進入對數生長期):空白對照組每只裸鼠局部注射 0.9%氯化鈉注射液 0.2 ml;IL-2組每只裸鼠局部注射 1 000 U/ml的 IL-2 0.2 ml;TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組、TDLN-Ⅲ組每只裸鼠局部注射效應細胞 (TDLN細胞)2×107/ml0.2ml以及 1 000 U/ml的IL-2 0.2 ml。以后,空白對照組裸鼠每周局部注射 0.9%氯化鈉注射液 0.2 ml,其他各組裸鼠每 3 d局部注射 1次 IL-2 0.2 ml(1 000 U/m l)。每周用游標卡尺測量并記錄腫瘤長徑(a)、短徑 (b),按體積 (V)=πab2/6計算腫瘤體積。根據腫瘤體積的變化描繪各組的腫瘤生長曲線,并計算抑瘤率,抑瘤率 (%)=〔1-(實驗組結束瘤體積 -實驗組開始瘤體積)/(空白對照組結束瘤體積 -空白對照組開始瘤體積)〕×100%。5周后脫頸處死裸鼠取出移植瘤標本。

1.2.4 流式細胞儀檢測移植瘤的腫瘤細胞凋亡率 將瘤塊用70%的乙醇固定,制成單細胞懸液,采用流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡率。具體方法按說明書進行。

1.3 統計學方法 采用 SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。計量資料以±s)表示;各組間是否有統計學差異采用General Linear Model中 Repeated Measures進行統計檢驗;如有統計學差異,每周各組間采用 One-way ANOVA進行統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 本組 30只裸鼠食管癌移植瘤成活率為 100%。

2.2 裸鼠移植瘤體積變化 General Linear Model分析顯示,實驗的不同時間 5組裸鼠移植瘤體積變化間差異有統計學意義(F=30.020,P＜0.01);且實驗進行 3、4、5周時,TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組和 TDLN-Ⅲ組裸鼠移植瘤體積與空白對照組及 IL-2組比較,差異均有統計學意義 (P＜0.01);實驗進行 3周及 5周時,TDLN-Ⅲ組裸鼠移植瘤體積較 TDLN-Ⅰ組顯著降低,差異有統計學意義 (P＜0.05,見表 1)。

2.3 各組裸鼠的抑瘤率 TDLN各組裸鼠的腫瘤抑瘤率大于IL-2組,且 TDLN-Ⅲ組抑瘤率最高 (見表 2)。

2.4 各組腫瘤細胞凋亡率比較 空白對照組、IL-2組、TDLN-Ⅰ組、TDLN-Ⅱ組、TDLN-Ⅲ組腫瘤細胞凋亡率分別為 (7.1±3.0)%、 (12.4±1.2)%、 (27.6±2.0)%、(33.1±4.5)%和 (39.1±1.5)%,組間差異有統計學意義(F=153.314,P＜0.01);且各組腫瘤細胞凋亡率間兩兩比較,差異均有統計學意義 (P＜0.05)。

表 1 實驗的不同時間 5組裸鼠移植瘤體積變化 (±s,mm3)Table 1 The transplantation tumor volume of five groups from week 1 to week 5

表 1 實驗的不同時間 5組裸鼠移植瘤體積變化 (±s,mm3)Table 1 The transplantation tumor volume of five groups from week 1 to week 5

注:與空白對照組比較,*P＜0.01;與 IL-2組比較,△P＜0.01;與TDLN-Ⅰ組比較,☆P＜0.05

組別 只數 1周 2周 3周 4周 5周空白對照組 6 29.4± 5.0 106.8±22.3 521.0±90.7 759.7±154.8 1172.5±274.8 IL-2組 6 29.9± 4.0 101.7±13.1 513.3±43.6 667.9± 98.1 1057.8±103.1 TDLN-Ⅰ組 6 34.9±14.1 115.1±21.9 312.9±32.0*△ 388.8± 33.6*△ 711.3± 39.6*△TDLN-Ⅱ組 6 30.3± 4.0 103.3±23.6 269.2±35.2*△ 345.5± 21.3*△ 612.3±186.8*△TDLN-Ⅲ組 6 30.4± 3.2 102.0±13.1 240.9±36.3*△☆ 337.0± 27.3*△ 502.1± 90.0*△☆F值.306 P值 0.647 0.737 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.628 0.498 40.188 30.082 19

表 2 各組裸鼠抑瘤率(%)Table 2 Inhibition ratio of transplantation tumor of four groups

3 討論

TDLN細胞含有豐富的淋巴細胞和樹突狀細胞,由于其特殊的位置,淋巴細胞受到樹突狀細胞遞呈的腫瘤抗原致敏,對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用[3]。但在患者體內,腫瘤細胞通過免疫抑制和免疫逃逸機制[4],致使腫瘤抗原不能得到有效的提呈,T淋巴細胞介導的免疫應答不能被有效激活[5]。

本實驗采取體外培養 TDLN細胞的方法,消除免疫抑制性細胞因子的影響,使樹突狀細胞能夠有效地遞呈抗原,T淋巴細胞能夠被有效地激活,主要通過 CD+8T細胞的分泌型殺傷作用和非分泌型殺傷作用殺傷腫瘤細胞。另外,TDLN細胞中的CD+56細胞對腫瘤細胞具有非特異性殺傷作用。

TDLN細胞容易獲得,手術時摘取即可,不需要從外周血或腫瘤組織中提取,而且 TDLN內淋巴細胞含量豐富,經培養完全能達到臨床使用的數量,不像淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)和腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL)提取獲得的增殖細胞數量較少,同時它還含有較多的已攝取腫瘤抗原的樹突狀細胞及少量自然殺傷細胞 (NK細胞)等。食管癌 TDLN細胞經體外培養后可以得到大量 T細胞和成熟樹突狀細胞,IL-2是淋巴細胞體外增殖的必備條件[6],在培養基中添加 GM-CSF和 IL-4能得到更多的成熟樹突狀細胞[6-7]。有人認為自體腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞,和 TDLN細胞共同培養后,具有更強的殺傷作用[8]。本實驗結果顯示,TDLN-Ⅲ組與 TDLN-Ⅱ組裸鼠移植瘤體積以及抑瘤率間無顯著差異,說明 TDLN中的樹突狀細胞已獲取腫瘤抗原,無需再次致敏,體外培養完全可以使其恢復活性。

本研究結果還顯示,TDLN-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤細胞凋亡率均顯著高于 IL-2組和空白對照組,表明 TDLN細胞可促進食管癌細胞凋亡,其中 TDLN-Ⅲ組腫瘤細胞凋亡率最高,TDLN-Ⅱ組次之,TDLN-Ⅰ組最低,表明經自身腫瘤抗原刺激后,TDLN細胞具有更強的促進腫瘤細胞凋亡的作用。

綜上所述,TDLN細胞在體外培養后回輸體內可以獲得有效殺傷腫瘤細胞的作用;TDLN細胞能誘導腫瘤細胞凋亡。TDLN細胞由個體腫瘤直接致敏,具有特異性,培養 TDLN細胞回輸人體有可能作為一種有效的個體化抗腫瘤免疫治療新方法。但 TDLN細胞是通過何種途徑誘導腫瘤細胞凋亡的,尚待進一步研究。

1 李啟亮,單保恩,張超,等.不同刺激劑誘導肺癌患者引流淋巴結細胞分泌細胞因子的研究 [J].細胞與分子免疫學雜志,2006,22(5):609-612.

2 何明,單報恩,李啟亮,等.肺癌淋巴結細胞培養及體內外的殺傷作用 [J].中華實驗外科雜志,2006,23(3):359-361.

3 Carriere V,Coliddon R,Jiguet-Jiglaire C,et al.Cancer cells regulate lymphocyte recruitment and leukocyte-endothelium interactions in the tumor-draining lymph node[J].Cancer Res,2005,65(24):11639-11648.

4 Kacani L,Wurm M,Schennach H,et al.Immuno-suppressive effects ofsoluble factorssecreted by head and neck squamous cell carcinoma on dendritic cells and T lymphocytes[J].Oral Oncol,2003,39(7):672-679.

5 Cohen PA,Peng L,Kjaergaard J,et al.T-cell adoptive therapy of tumors:mechanisms of improved therapeutic performance[J].Crit Rev Immunol,2001,21(13):215-248.

6 金鷹,唐玫,李國明 .實用淋巴細胞培養技術 [J].激光生物學報,2000,9(3):75-78.

7 李秋平.細胞因子與樹突狀細胞分化誘導 [J].外醫學腫瘤學分冊,2004,31(10):742-744.

8 Sabel MS,Arora A,Su G,et al.Adoptive immunotherapy of breast cancer with lymph node cells primed by cryoablation of theprimary tumor[J].Cryobiology,2006,53(3):360-366.