三硝基甲苯對斑馬魚半致死濃度和致畸率的測定

謝 松,王 佳,葉正芳,盧勝濤,郭 華

(1.河北大學生命科學學院,河北保定071002;2.北京大學環境技術研究中心,北京100871;3.河北大學 圖書館,河北 保定 071002)

1 引言

2,4,6-三硝基甲苯(TNT)是一種軍事和民用廣泛應用的含能材料,用量居首位[1],具有高毒性和致變性,它可通過呼吸系統、消化系統及皮膚而進入生物體內,導致血相改變、紫紺、白內障、正鐵血紅蛋白血癥和中毒性肝炎等。由于土壤對 TNT有很強的吸附作用,因而如果廢水中的 TNT不經過處理直接排放,TNT就會很快滲入地下,積存于土壤中,將嚴重危害環境,TNT對水體和土壤環境的污染早已受到重視。由于TNT廢水的化學穩定性及生物毒性,單獨使用一項技術處理該廢水,很難達有效的控制 TNT的含量[2～5]。

斑馬魚(Danio rerio,俗稱zebra fish)是常見的暖水性(21～32 ℃)觀賞魚,鯉科,個體小(4～5cm),是標準實驗生物之一,其作為生態毒理學的實驗動物模型廣泛應用于環境毒理試驗研究中[6～7]。斑馬魚作為模式生物,可以通過檢測乙酰膽堿酯酶的活性、谷胱甘肽S-轉移酶的活性、P450酶系(屬于單加氧酶(monooxygenase),又稱為多功能氧化酶(m ixed function oxidase)、羥化酶(hydroxy lase),因其還原態的吸收峰在450nm處,故名。)7-乙氧基-3-異吩唑酮-脫乙基酶(EROD)的活性進一步分析不同濃度的有毒物質的不同代謝反應,從而為廢水處理提供有利的數據參考[8～10]。

目前,斑馬魚急性毒性實驗是監測工業污染及污水檢測的重要手段之一[11]。隨著發育生物學和分子遺傳學領域的研究進展,應用斑馬魚胚胎來研究污染物的致毒機理將成為生態研究中的重要手段。斑馬魚胚胎發育直至孵化的72h內可以觀察到近20種不同表現的反應指標,見表1[12]。

表1 可以觀察的毒理學終點

鑒于胚胎毒性測試對于絕大多數化學物質的敏感度高于成魚急性毒性實驗,經濟合作與發展組織(OECD)在1998年將上述方法列入測定單一化學品毒性的標準方法之一,并制定了詳細的操作指南(OECD TG212)[13]。現在,這項技術已經被廣泛應用于環境有毒物質的生態風險乃至人類安全的評估中。隨著中國經濟和國防事業的飛速發展,爆破器材的研發和應用,使得三硝基甲苯,對河流和空氣造成了一定的污染。本試驗通過不同濃度的三硝基甲苯溶液對斑馬魚的致死程度不同來計算其半致死濃度。在污水處理方面有重要作用。

2 材料和方法

試驗容器選用1L燒杯、試驗用水為經曝氣的自來水、試驗魚苗購于河北省保定市花鳥魚蟲市場、三硝基甲苯購于試劑公司。

2.1 TNT濃度測定

由于TNT屬于難溶于水,所以不能保證所加TNT粉末在短時間內完全溶于水,這對試驗的進度和準確度造成了影響,于是采用配置高濃度 TNT溶液,使用時再稀釋的方法進行試驗。

2.1.1 TNT溶液配制

取30mgTNT粉末置于500m L蒸餾水中,25℃水浴中放置一周左右,期間隨時晃動,待用是將未溶的TNT過濾,得到高濃度 TNT溶液母液,備用。再通過亞硫酸鈉-氯化十四烷基吡啶分光光度法測定溶液中TNT的含量。

2.1.2 繪制標準曲線

取6個25m L的容量瓶,分別加入10mg?L-1TNT 標準溶液 0.5 、1、3 、5、7 、10m L,依次加入 10%亞硫酸鈉溶液2m L,0.5%氯化十四烷基吡啶溶液2m L,然后稀釋到刻度,混勻后用2cm比色皿,以蒸餾水作為空白參比,在466nm波長處,測量吸光度。繪制出測定TNT的標準曲線,當25m L溶液中含有TNT0～100μg時,符合比爾定律,標準曲線的相關系數大于 0.999[14～16],見圖1。

圖1 TNT標準曲線

2.1.3 自制TNT溶液濃度測定

通過分光光度計測量吸光度和標準曲線的對比,測的1m L自制 TNT溶液中 TNT含量為45.017μg。

2.2 試驗魚處理

將新購買回的魚苗正常喂養一周以上,每天上午換水,早晚喂食各一次,水溫保持在27℃左右。喂養期間無死亡現象,表明魚苗無疾病隱患。試驗正式開始前1d停止喂食,期間無魚苗死亡,符合試驗魚要求。

2.3 試驗步驟

正式的試驗設置6個濃度組,3個平行,其中有1個為空白對照組,5個試驗組。試驗組TNT含量分別為(TNT溶液母液的濃度為 45.017μg?m L-1)。設置對照組為 0μg? L-1(45.017μg?m L-1×0m L);濃度 1為 2 250.85μg?L-1(45.017μg?m L-1×50m L);濃度 2 為 3 151.19μg?L-1(45.017μg?m L-1×70m L);濃度 3為 4 051.53μg?L-1(45.017μg?m L-1×90m L);濃度 4為4 951.87μg?L-1(45.017μg ?m L-1×110m L);濃度5為 5 852.21μg? L-1(45.017μg? m L-1×130m L)。

將配置好的TNT溶液加入燒杯中混勻,再隨機加入10條魚苗,24 h后對死亡魚苗進行計數,用針刺魚苗不活動的為死亡。

2.4 孵化致畸試驗

將所購買的魚苗,雌雄分開飼養,每天2次喂魚,水溫保持在28±1℃。光周期為 14(亮)：10(暗)。待孵化試驗的前一天選取體型健康游動活潑的雄魚5條和腹部有明顯隆起的雌魚3條,放于同一魚缸中同時用隔板隔離,過夜,于次日早晨取出隔板,約1～2h后,去觀察是否有魚卵并收集于培養皿中沖洗干凈。選取透明有雙層膜的魚卵進行下一步試驗。

TNT的濃度梯度分為以下5個：(TNT溶液母液的濃度為 23.194μg?m L-1);對照組為 0μg?L-1(23.194μg?m L-1×0m L);濃度1為 463.88μg?L-1(23.194μg?m L-1×20m L);濃度2為 927.76μg?L-1(23.194μg?m L-1×40m L);濃度3為1 855.52μg?L-1(23.194μg?m L-1×80m L);濃度 4為3 711.04μg?L-1(23.194μg?m L-1×160m L)。每組有3個平行,每組50枚魚卵。魚卵大約72h天后孵化成功。每天記錄1次魚卵發育過程中的致畸和死亡情況。

2.5 實驗結果

TNT對成魚致死的情況如圖2所示。

圖2 tn t對成魚致死的情況

24h半致死濃度(LC50)根據圖2可得24h半致死濃度即LC50=3 711.33μg?L-1。孵化率和致畸情況如表3所示。

表3 不同濃度TNT 72h孵化率和致畸情況

3 結語

根據對24 h內未死的魚苗進行觀察,發現處理的第1個24h非常關鍵,在第1個24h未死的魚苗,后續時間內死亡率會大幅度降低的情況,具體適應機理還不明確,仍需要從體內各種酶變化情況進行進一步研究。致畸率的結果表明三硝基甲苯能抑制斑馬魚胚胎的發育,高濃度三硝基甲苯還能引起斑馬魚幼苗畸形。由胚胎的孵化率和魚苗的畸形率可以看出三硝基甲苯對胚胎的影響隨其濃度的增高而突然加大,在三硝基甲苯濃度為463.88μg?L-1以下時,胚胎的孵化率和畸形率上升較慢,濃度在463.88μg?L-1到 927.76μg?L-1之間時,平均孵化率下降15%,畸形率增加將近一倍,而濃度大于927.76μg?L-1小于 1855.52μg?L-1時,孵化率下降32%,畸形率增加 6倍,濃度達到 1855.52μg?L-1時,孵化率不到一半,畸形率達到90%以上,當濃度達到3711.04μg?L-1時胚胎出現全致死效應。這表明高濃度的TNT(大于927.76μg?L-1)對胚胎發育毒性極大。研究表明,胚胎的毒性測試對于絕大多數化學物質的敏感度高于成魚毒性實驗[12],實驗也證明了三硝基甲苯對胚胎的發育的影響較成魚更為顯著。

中國(GB4274-84)梯恩梯工業水污染物排放標準 0.5～30.0mg?L-1(總硝基化合物,以2,4-DNT和α-DNT計)。本實驗結果基本屬于排放標準以內,但是如果按照標準的最高值排放,將對環境生物產生不可恢復性的影響,所以筆者認為中國梯恩梯工業水污染物排放標準上線過高,應對污染物的排放量進行更準確的規定。

致謝：感謝北京大學葉正芳教授對本文的指導。

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