抗菌肽分子設(shè)計研究進展

宋雪瑩，馮興軍，李 靜

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱150030）

抗菌肽在自然界中分布廣泛，種類繁多，已相繼從細(xì)菌、真菌、兩棲類、高等植物、哺乳動物以及人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得[1-2]。與普通抗生素相比，抗菌肽的抗菌譜廣，相對分子質(zhì)量小，熱穩(wěn)定性好，無免疫原性，不易產(chǎn)生耐藥性，對真核細(xì)胞幾乎沒有作用，只對原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞有作用，但活性不夠理想，成為影響抗菌肽應(yīng)用的限制因素之一。研究抗菌肽構(gòu)效關(guān)系，通過分子設(shè)計與改造進一步提高抗菌肽的活性成為目前該領(lǐng)域的研究熱點。本文綜述了近年來抗菌肽分子設(shè)計的最新進展與成果，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供理論依據(jù)。

1 抗菌肽分子設(shè)計的主要原則

抗菌肽作為一種多肽序列，由氨基酸組成，生物學(xué)活性與多肽分子的多種結(jié)構(gòu)參數(shù)密切相關(guān)，包括多肽分子的等電點、靜電荷、疏水性、親水性、二硫鍵及其氨基酸序列、α-螺旋等參數(shù)。

1.1 含有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽

目前大部分抗菌肽的結(jié)構(gòu)功能研究以及分子設(shè)計主要集中于兩親α-螺旋抗菌肽。α-螺旋抗菌肽分布最廣，數(shù)量最多，并具有廣譜抗性；該類抗菌肽長度短，易于化學(xué)合成；線性結(jié)構(gòu)簡單，易于通過圓二色譜分析和多維核磁共振進行結(jié)構(gòu)測定[3]。

α-螺旋在抗菌肽發(fā)揮抗菌作用的過程中具有重要作用。α螺旋是破壞、裂解細(xì)菌的主要結(jié)構(gòu)，當(dāng)抗菌肽結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜上時，α螺旋相互聚集使細(xì)胞膜形成孔洞，細(xì)胞質(zhì)外溢而致細(xì)菌死亡[4-6]。經(jīng)1H NMR分析表明，當(dāng)用Ala替換抗菌肽分子中的Pro殘基后，其二級結(jié)構(gòu)由伸展?fàn)钷D(zhuǎn)變成為螺旋狀，導(dǎo)致其膜插入程度的增加和跨膜遷移能力的提高，更容易進入細(xì)胞質(zhì)及胞質(zhì)靶位點[7]。

有研究認(rèn)為，N-端的α-螺旋結(jié)構(gòu)域很重要，足以維持抗菌活性[8]。目前仍未研究出抗菌肽螺旋度與抗菌活性的定量關(guān)系。主要原因是由于抗菌肽的活性受多種因素決定。氨基酸替換除改變螺旋度外，同時也導(dǎo)致其他結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變，如疏水力矩、疏水性、極性和非極性結(jié)構(gòu)域的大小以及電荷數(shù)和電荷分布等[9-10]。

1.2 特殊殘基對抗菌活性的影響

在抗菌肽天然結(jié)構(gòu)中有部分氨基酸被另一種氨基酸取代，可改變抗菌肽的殺菌能力。在保留兩親螺旋結(jié)構(gòu)的前提下進行單殘基突變，用甘氨酸取代抗菌肽Ovispirin-1第10位的異亮氨酸，結(jié)果克服了對紅細(xì)胞的溶血性，并提高了抗菌活性[11]。人工合成了[A6]-IsCT多肽，與天然抗菌肽IsCT相比，第6個氨基酸殘基Trp被Ala所替換。被替換后的[A6]-IsCT幾乎無抗菌活性[12]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，用Leu取代Pro可使人工合成的抗菌肽P18的活性下降 2 倍[13]。

1.3 抗菌肽的陽離子性

抗菌肽的陽離子性與抗菌肽的抗菌機制有關(guān)，由于細(xì)胞膜外帶有負(fù)電荷，所以呈陽離子性的抗菌肽易與其結(jié)合并通過細(xì)胞膜，從而使病原細(xì)胞瓦解。此外，在不同的pH下，氨基酸帶有不同的電荷，如在中性或偏酸性條件下，Lys和Arg都帶正電荷，所以含Lys和Arg受pH變化影響較小；富含His的抗菌肽受pH變化影響較大[14]。因此增加帶正電氨基酸的數(shù)量，或改變其在肽鏈中的位置，均可影響抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)，從而進一步影響其抗菌活性。

1.4 抗菌肽C端酰胺化和N端無多余的殘基對抗菌活性的影響

抗菌肽C端酰胺化和N端無多余的殘基都將增加抗菌肽的抗菌活性。由于C端酰胺化可引起多肽靜電荷的增加，使得進入靶細(xì)胞的能力增加，抗菌能力加強。N端插入細(xì)胞膜是抗菌肽殺死細(xì)胞的必需條件，N端含有多余的殘基將增加N端的柔韌性和擺動性，若破壞兩親結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定，造成N端難以插入細(xì)胞膜，將導(dǎo)致活性降低。對人工合成的抗菌肽P18逐一去除N-端和C-端氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)隨著末端殘基的去除，其抗菌活性成倍下降。

1.5 抗菌肽的親水性和疏水性

抗菌肽活性是親水基團和疏水基團相互作用的結(jié)果。疏水作用對其活性的影響是通過改變肽鏈中Leu、Ile、Val數(shù)量實現(xiàn)的。增加疏水性氨基酸能夠增加抗菌肽形成兩性α-螺旋的能力，而α-螺旋的增加也提高了抗菌肽的穩(wěn)定性。但是增加分子的疏水性，抗菌肽的抗菌活力和對哺乳類動物細(xì)胞的溶血活性同時增加，這是由于疏水基團在抗菌肽插入細(xì)胞膜的過程中起關(guān)鍵作用。肽鏈?zhǔn)杷娴恼姾煽赡軐咕牡娜苎钚杂兄匾绊憽Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，Melittin抗菌活性和溶血性隨著疏水力矩降低而減弱，直至消失[15]。也有報道，平均疏水力矩的變化比疏水性和螺旋度的變化對抗菌活性的影響更大[16]。

2 抗菌肽分子設(shè)計的方法

2.1 以天然抗菌肽為模板設(shè)計合成類似物

根據(jù)天然抗菌肽，以其為設(shè)計模板，在一個或多個序列位置上氨基酸殘基發(fā)生改變，或改變肽鏈長度，設(shè)計合成新的抗菌肽。該方法涉及到在活性中起重要作用的氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域。利用這種方法獲得許多的類似物已被設(shè)計合成并用于抗菌肽構(gòu)效關(guān)系研究。

2.2 雜合肽的設(shè)計

根據(jù)GenBank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列，串聯(lián)后人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段，克隆于原核表達(dá)載體pET32中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-B7-B5，將其轉(zhuǎn)化于E.coliBL21中，實現(xiàn)了重組蛋白B7-B5（rB7-B5）的過表達(dá)，B7-B5表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的36.6%，對豬胸膜肺炎放線桿菌和耐藥性大腸桿菌具有很好的抑菌活性[17]。將 cecropinA（1-8）和 magainin2（1-12）串聯(lián)起來，構(gòu)建至含有人泛素融合蛋白 pQE30重組表達(dá)質(zhì)粒上，在大腸桿菌M15中得到了高效異源表達(dá)[18]。

2.3 氨基酸殘基替換

改變抗菌肽的某個氨基酸殘基可影響抗菌肽的活性，且該方法在克服抗菌肽毒性問題上有理想的效果。在研究LfcinB時，進行單殘基突變，用丙氨酸取代抗菌肽LfcinB第6位和第8位的色氨酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中任何一個色氨酸被取代，都會造成抗菌肽失去抗菌活性[19]。

2.4 截取天然抗菌肽的部分序列

人工合成的多肽MCF，由Melittin的C端15個氨基酸殘基組成，MCF包含了Melittin的大部分兩親片段，抗菌活性比Melittin高5~7倍，而溶血活性低300倍。MCF的類似物MCFA是兩個陽離子殘基從C端轉(zhuǎn)到N端形成的，與Melittin的抗菌活性相當(dāng)，但溶血活性僅比MCF高一點。說明抗菌肽的生物物理學(xué)特性與其生物學(xué)活性密切相關(guān)[20]。

3 抗菌肽分子設(shè)計的主要步驟

選擇天然活性相對較高的作為母本抗菌肽，結(jié)合結(jié)構(gòu)參數(shù)，進行分子設(shè)計，設(shè)計系列抗菌肽分子衍生物；通過多肽分析軟件對設(shè)計抗菌肽分子衍生物分析，對其進行優(yōu)化；通過軟件分析優(yōu)化后，選出結(jié)構(gòu)參數(shù)理想、具有高活性潛力的新型抗菌肽分子，對其進行化學(xué)合成；檢測化學(xué)合成抗菌肽的活性，進一步驗證篩選；測定篩選的具有理想活性的新型抗菌肽結(jié)構(gòu)，探討抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，在獲得新型抗菌肽的同時，進一步完善抗菌肽構(gòu)效關(guān)系和分子設(shè)計的理論基礎(chǔ)。

4 展望

抗菌肽具有很多優(yōu)點，但依然存在一定問題。抗菌肽較其他抗菌藥物相比活性較低，所以通過改變抗菌肽結(jié)構(gòu)的方式提高活性。但有時在提高抗菌活性的同時也一定程度的提高了細(xì)胞溶血性。綜合利用改變抗菌肽活性參數(shù)，設(shè)計需高活性，低溶血性的抗菌肽仍是需要繼續(xù)研究的問題。

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