結核分枝桿菌抗原MPT51及其臨床應用研究進展

彭 超,王洪海

(1復旦大學遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室,上海200433; 2江西中醫學院基礎醫學院)

結核分枝桿菌抗原MPT51及其臨床應用研究進展

彭 超1,2,王洪海13

(1復旦大學遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室,上海200433; 2江西中醫學院基礎醫學院)

結核分枝桿菌;MPT51蛋白

近年來,結核病的發病率有升高趨勢,是人體免疫缺陷病毒(H I V)感染患者的主要死因。結核病的病原菌主要為結核分枝桿菌,隨著多耐藥結核分枝桿菌和H I V共感染的發生率增加,迫切需要研制新的疫苗和抗結核藥物以及可靠的早期診斷方法。結核分枝桿菌能分泌大量不同種類的免疫原性蛋白,其中MPT51/MPB51是主要分泌性蛋白之一,能結合纖維結合素;亦是結核病診斷和疫苗的候選蛋白之一。現對MPT51的基礎研究概況及其應用進展綜述如下。

1 MPT51的結構組成及特性

1.1 MPT51基因 MPT51基因由mpt51基因編碼、900個堿基組成,其核苷酸已被克隆。MPT51基因密碼子鄰近Ag85A,但不屬于同一個操縱子。mpt51基因有自己的啟動區,位于fbpA的下游區,且與Ag85復合物有40%同源性。卡介苗(BCG)中的MPB51是BCG培養濾液中主要的分泌蛋白之一,由mpb51基因編碼。mpb51基因位于Ag85A下游,距離179 bp,編碼299個氨基酸,其中33個氨基酸是信號肽,266個氨基酸是相對分子質量為27 807.37 Da的成熟蛋白。MPB51與Ag85復合體有37%～43%的同源性,二者有2個同源性很強的區域,代表保守的功能域,位于氨基酸端的22PYENLMVPSPS MGRD IPVAFLAGGPHAV2YLLD233和內部區域的1892NNTRVWV2195。189～195區域同時亦是MPB51最輸水區域、Ag85復合物組成部分和FN結合位點。

1.2 MPT51蛋白 MPT51蛋白相對分子質量為27 kD,是結核分枝桿菌在生長過程中分泌至細胞外的主要蛋白之一,約占細胞外蛋白的15%。其在胞質溶膠和細胞表面以三聚體形式存在[1],與Ag85復合物有交叉反應,屬于同一個分泌蛋白家族。在培養濾液中MPT51和Ag85復合物比例是1∶3,二者既有相同又有不同的抗原決定基,在結核桿菌細胞中發揮不同作用。

MPT51蛋白的晶體結構分辨率為1.7!,與Ag85復合物中的Ag85B和Ag85C一樣,折疊成α/β水解酶。但MPT51蛋白不含有分支酰基轉移酶的催化三聯體(Ser2His2 Glu),且缺少α,α′2海藻糖單霉菌酸酯結合位點和活性位點,因此MPT51蛋白無分支酰基轉移酶的功能。MPT51蛋白可能是一類新的非催化性的α/β水解酶,其結構類似于某些整合素與糖結合蛋白,因此MPT51蛋白可能在宿主組織黏附上有一定作用,其配體可能包括了血清蛋白纖維結合素(FN,存在于血漿和組織中的相對高分子質量糖蛋白,在細胞發育、能動性、粘連、吞噬作用和損傷修復、炎癥反應等方面起重要作用)和小分子糖。Xolalpa等[2]研究發現, MPT51蛋白具有結合和激活人的纖溶酶原產生纖維蛋白溶酶(可直接降解細胞外基質和基底膜如層粘連蛋白和纖維結合素,并間接活化基質金屬蛋白酶和彈性蛋白酶)的作用,此可能與結核分枝桿菌的侵入散播和造成組織損傷有關。

2 MPT51的臨床應用

2.1 MPT51在結核病診斷中的應用 MPT51是結核診斷的潛在生物標識物。Ramalingam等報道,MPT51對175例治療前痰涂片和培養陽性結核患者診斷中的敏感性和特異性分別為71%和95%。Bethunaickan等[6]研究發現,痰涂片和培養陽性結核患者的血清抗MPT51的IgG、IgA和Ig M敏感率分別為57%、47%和13%,IgG特異性為98%;IgG+IgA敏感性為71%,特異性為95%;在痰涂片陰性而培養陽性患者中,IgG陽性率為34%;在痰涂片和培養陰性,X射線陽性患者中,IgG陽性率為42%。

Ramalingam等[7]研究發現,MPT51免疫檢測在H I V21陽性患者結核早期診斷中有重要作用。Singh等[8]用臨床結核癥狀出現前幾個月H IV結核共感染患者的血清分析了結核分枝桿菌培養濾液蛋白對于亞臨床診斷的作用,約有12個抗原被上述血清所識別。其中MPT51和蘋果酸合酶(MS)能被90%的H IV結核共感染患者血清識別。表明MPT51可用于H IV陽性結核病高危人群的診斷。Wanchu等[9]研究發現,痰涂片陽性的H IV-TB+和H IV+TB+患者的敏感性約達80%,特異性>97%。表明MPT51和MS可作為發病初期亞臨床結核患者的診斷標識物。

當MPT51蛋白與其他抗原性蛋白結合用于診斷時可提高其敏感性和特異性。MPT51和GlcB能被80%印度人的H IV陰性痰涂片陽性結核患者的血清抗體所識別。Achkar等[10]研究表明,MPT51和GlcB結合的血清學診斷可輔助痰涂片鏡檢作為肺結核快速診斷方法。Melo Cardoso等[11]報道,重組蛋白MPT51和GlcB對結核病患者血清學診斷的敏感性、特異性分別為75.5%、90.8%。Raja等[12]的實驗分析了結核分泌蛋白38 kD、30 kD及MPT51、胞質蛋白16 kD的血清學診斷作用。結果顯示MPT51檢測結核血清的敏感性和特異性均很高,特別是當MPT51、38 kD、30 kD和胞質蛋白16 kD蛋白結合診斷時,敏感性和特異性分別為91%和96%。

2.2 MPT51在結核病疫苗研制中的應用 基因疫苗是疫苗研制的第三次革命。MPT51能結合細胞外基質的FN,在宿主組織附著和毒力方面有重要作用。Ana Paula Junqueira2Kipnis小組研究發現,感染了結核桿菌的BALB/c小鼠脾臟和肺部的MPT51特異性IFN 2γ+T淋巴細胞數量有所增加;對未感染結核桿菌的BALB/c小鼠接種 rMPT51/F IA和 rMPT51/CpGD2 NA疫苗能增加IFN 2γ+T淋巴細胞的數量;接種 rMPT51/F IA后能誘導MPT51特異性的體液反應;接種60 d后,肺組織中結核桿菌的菌落(CFU)數量減少了2個log。表明MPT51是具有潛力的DNA疫苗[13]。Yukio Koide小組還研究了編碼巨噬細胞炎癥蛋白(M IP21α)和MPT51的DNA疫苗對于誘導特異性T淋巴細胞的作用。發現編碼融合蛋白的DNA疫苗較僅編碼MPT51的DNA疫苗能顯著誘導小鼠產生更多的抗原特異性T細胞。編碼M IP21α抗原的融合蛋白DNA疫苗能通過趨化因子受體有效遞呈給抗原遞呈細胞,并誘導更高水平的抗原特異性T淋巴細胞反應[14]。

由于單核細胞增生李斯特氏菌(L.M.)能在專職抗原遞呈細胞(如巨噬細胞和樹突狀細胞)內逃離吞噬溶酶體,在細胞質中存活并繁殖,還可誘導Th1型免疫反應,因此可將外源性抗原的DNA引入L.M.構建重組L.M.活疫苗。Yukio Koide小組構建了攜帶Ag85A、Ag85B、MPB/MPT51真核表達質粒的自毀型L.M.,用該細菌重組體感染可誘導這些基因在小鼠巨噬細胞株J774A.1中的表達。C57BL/6小鼠腹膜內免疫此細菌重組體能誘導PPD特異性的細胞免疫反應如腳跟反應、脾細胞增殖反應、脾細胞IFN γ2的分泌等,顯示出此細菌重組體抗結核感染的效果。另有研究發現,靜脈免疫此重組疫苗的BALB/c小鼠免疫保護反應強于BCG。Yukio Koide小組還用慢性病毒作為載體。研究了MPT51作為疫苗的作用,結果發現氣管內免疫改良后攜帶MPT51基因的第三代慢性病毒疫苗2周后,能誘導縱膈淋巴結產生MPT51特異的T細胞。此疫苗在肺部能產生MPT51特異性記憶細胞,但在淋巴結中不能。此外,MPT51慢性病毒疫苗氣管內免疫能顯著降低結核桿菌在肺部的數量。

綜上所述,MPT51是結核分枝桿菌主要的分泌蛋白和重要保護性抗原之一,在結核病診斷和新型疫苗研制方面具有重要價值。

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國家十一五重大傳染病專項資助項目(2008ZX10003005)。

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