三種多糖對抗人紅細胞 A、B抗原單克隆抗體穩定性的影響

張坤娟,鄧郁青,弋國紅,張紅中*,王從印,張雪迎,王惠芬

(1河北醫科大學生物醫學工程中心,石家莊 050017;2河北醫科大學基礎所)

抗 A、抗 B血型定型試劑是 ABO血型鑒定的必需試劑。目前臨床使用的均為單克隆抗體(以下簡稱單抗)血型試劑,其優點為生產成本低、節約血資源、特異性高、親合力好、操作簡單方便,但穩定性欠佳,主要表現為鄰近效期,抗體效價下降。已有文獻報道,海藻糖對單抗的熱穩定性具有保護性作用[1]。2002～2005年,我們觀察了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對抗人紅細胞 A、B抗原腹水型單抗穩定性的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 三株抗人紅細胞 A抗原雜交瘤細胞和三株抗人紅細胞 B抗原雜交瘤細胞,均分泌 IgM型抗紅細胞抗原單抗,由河北醫科大學生物醫學工程中心提供。將 1×105個雜交瘤細胞注入 BABL/c小鼠腹腔,7～10 d后可見腹腔有腹水產生,用注射器針頭抽取腹水,制備抗人紅細胞 A、B抗原腹水型單抗備用。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖均購自北京化工廠,分析純。人 A、B、O型紅細胞購自上海血液生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含多糖抗體稀釋溶液的制備 定量稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖,加入生理鹽水中制備成葡萄糖、蔗糖、麥芽糖穩定溶液。將三株抗人紅細胞 A抗原單抗腹水和三株抗 B抗原單抗腹水分別等比例混合后,按 6%體積比加入至 3組多糖溶液中,并加入終濃度為 1∶2 000的疊氮鈉防腐,制備成抗紅細胞抗原的單抗含糖稀釋溶液。

1.2.2 抗人紅細胞 A、B抗體效價測定 將待測腹水抗體溶液用生理鹽水進行 2倍連續稀釋,0.2 ml/管,稀釋至第 10管,第 11管做生理鹽水對照,加入等量相應血型的 2%紅細胞懸液振蕩混勻,室溫放置 15m in,1 000 r/min離心 1 min后觀察結果,以產生“+”凝集的待檢液最高稀釋度計算效價。

1.2.3 三種多糖有效穩定濃度的確定 將已制備的含不同濃度糖的單抗稀釋溶液放置 56℃、30 min,并測定加熱前后抗體效價,確定有效穩定濃度。結果置 56℃、30min后,抗 A鹽水組抗體效價滴度下降明顯,抗 B鹽水組抗體已測不出凝集效價,0.1～0.8mol/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖溶液對單抗效價均有一定穩定作用,同一種多糖高濃度的穩定效果優于低濃度,蔗糖和麥芽糖穩定作用優于葡萄糖,三種多糖的最佳有效穩定濃度為 0.4mol/L。

1.2.4 三種多糖對抗人紅細胞單抗抗體效價的影響 根據 1.2.3有效穩定濃度的初篩結果,按1.2.1分別制備濃度為 0.4 mol/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖紅細胞單抗稀釋溶液,分別計為葡萄糖組、蔗糖組、麥芽糖組,同法制備生理鹽水對照(鹽水組)單抗稀釋溶液,均置 37℃、室溫、4℃三種溫度條件存放,定期監測抗體效價變化,監測時間間隔分別為 1周(共 8周)、4周(共 6個月)和 3個月(共 24個月)。

2 結果

37℃、2周時,葡萄糖、蔗糖、麥芽糖組抗體效價均未降低,鹽水組抗 A效價由放置前的 1∶512降至1∶128、抗 B效價由 1∶256降至 1∶64。 4周時 ,三種多糖組抗 A效價仍未降低,抗 B效價蔗糖組未降低、葡萄糖和麥芽糖組降低了 1個稀釋度;抗 A效價鹽水組則降為 1∶64、抗 B降為 1∶8。 8周時,鹽水組已測不出凝集效價,抗 A、抗 B效價蔗糖組分別下降了 1和 2個稀釋度、葡萄糖和麥芽糖組下降了 2和 3個稀釋度。室溫、4個月時,三種多糖組抗體效價保持不降,鹽水組抗 A效價降至 1∶64、抗 B降至1∶32。6個月時,抗 A效價鹽水組降至 1∶4,蔗糖和麥芽糖組未降,葡萄糖組下降了 1個稀釋度;抗 B效價鹽水組已檢測不出陽性結果,蔗糖組下降了 1個稀釋度,麥芽糖和葡萄糖組效價分別下降了 2和3個稀釋度。4℃時鹽水組抗 A、抗 B效價 6個月時均未降低,12個月時均下降 1個稀釋度,18個月時下降 3個稀釋度,24個月抗 A降至 1∶16、抗 B降至1∶4;而各多糖組抗 A、抗 B效價保存至 24個月時仍保持不變。

3 討論

正確測定和判讀受血者和獻血者的血型是臨床輸血的關鍵,而具有穩定可靠質量的血型定型試劑是保證正確測定的前提。目前,臨床常用的國內單抗血型定型試劑與進口試劑相比在穩定性等方面還存在一定差距,主要表現為隨儲存時間的延長或非冷鏈運輸等原因,血型試劑效價有不同程度地下降,凝集強度變弱,對于一些抗原性較弱的血樣,可能發生血型的錯誤判讀[3,4]。

解決血型單抗試劑長期保存穩定性降低的方法主要有兩種,一是增加試劑中抗體的含量,提高血型單抗初始效價;另一種是加入適量的抗體蛋白穩定劑,如一定量的小鼠腹水、腹水提取蛋白或酪蛋白等。前一種方法需要消耗大量的人力物力,增加試劑的成本,而加入適當的穩定劑則更為方便實用。本研究結果顯示,不同血型抗體的穩定性存在差異,放置溫度對血型試劑的效價有很大影響,0.1～0.8 mol/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對抗 A、B單抗均有一定的穩定作用,高濃度穩定效果優于低濃度,三種多糖中以蔗糖穩定作用最好。以 0.4 mol/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為穩定劑,在 37℃下腹水單抗的效價可延長至 2～3周;在室溫條件下,效價可延長至4～6個月;在 4℃下,效價可延長至 24個月。

綜上所述,臨床血型試劑不宜在較高溫度條件下長時間放置,平時應 4℃保存。采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖(尤其是蔗糖)作為穩定劑,可明顯提高單抗的穩定性,有效延長抗體的使用期限,降低生產成本。

[1]計融,江濤,李業鵬,等.海藻糖對單克隆抗體熱穩定性保護作用的研究[J].中國食品衛生雜志,2001,13(2):10-12.

[2]中國生物制品標準化委員會.中國生物制品規程 [M].北京:化學工業出版社,2000:601-604.

[3]黃麗雅,陳勇高,周越勤,等.抗 A和抗 B血型定型試劑穩定性觀察及對亞型檢測的影響[J].現代檢驗醫學雜志,2007,22(6):20-23.

[4]孫愛農,馮志廣,李兆蘭,等.單克隆抗 -A(B)試劑質量鑒定與分析[J].中國誤診學雜志,2004,4(1):34-36.