瓊脂—磷灰石仿生納米復合材料修復兔脛骨缺損的實驗研究

周 劍,張建湘*,湯 健,李全利,周 健,蔡華瓊

(1安徽醫科大學附屬第一醫院,合肥 230032；2安徽醫科大學附屬口腔醫院；3安徽口腔疾病研究省級實驗室)

自體骨移植是臨床治療骨缺損的金標準,但存在對患者的二次創傷以及取材量少的缺點,異體骨則存在著一定的免疫排斥反應以及疾病的傳播。人工骨的研究為解決這個難題帶來了希望[1,2]。2009年 3～10月,本研究擬用瓊脂溶膠(AG)調控羥基磷灰石(HA)晶體的生長,合成新型 AG-HA納米復合骨修復材料,通過制作兔脛骨臨界性骨缺損動物模型來評價其促進骨缺損修復的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔 20只,購于安徽醫科大學動物實驗中心,體質量 2.5～3.5 kg,雌雄不限。其中實驗組 16只,術后 2、4、8、12周各 4只,4只為空白對照組。實驗過程中對動物的處置參照國家科學技術部 2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 試劑 溶液沉淀合成、非燒結 HA粉末(微米級,四川大學口腔醫學院材料研究室提供)；AG(基因科技(上海)有限公司)；其他試劑為分析純試劑。

1.3 復合材料的合成 將一定量的非納米 HA的鹽酸溶液,加入一定量的 AG中,調整反應體系的pH值為 7～8,然后將反應形成的復合物冷凍干燥后即得 AG-HA復合材料。

1.4 動物模型制備 根據文獻制備兔脛骨上端腔隙性骨缺損模型[3]。3%戊巴比妥鈉按 1 mg/kg行耳緣靜脈注射麻醉,采用靜脈靜滴針術中留置靜脈通道補液。待麻醉效果滿意后,固定四肢,剪除雙膝以下小腿的兔毛,碘伏消毒,鋪洞巾,以膝關節以下脛骨內髁的平臺為基點,做一約 3 cm縱行切口。分離軟組織,仔細剪除內髁平臺周圍骨膜,用口腔科磨鉆切除脛骨內髁的平臺關節面以近皮質骨約 1.5 cm×0.8 cm大小,刮匙刮除骨髓及松質骨,沖洗后仔細止血。實驗組填塞實驗材料,壓緊填實,對照組未處理。全層縫合皮膚,外用手術切口敷料包裹切口。術中采用靜脈通道補液 250 ml,配80萬 U青霉素鈉,術后第 3天靜脈補液 250 ml,配 40萬 U青霉素鈉,術后未予以固定,籠養,常規飼養。

1.5 觀察指標 主要觀察指標:①X線檢查:于術后 2、4、8、12周處死動物后取雙下肢拍片,觀察骨缺損愈合情況、骨痂密度等。攝片條件為 0.4 s,50 mA,40 kV。②病理切片:取下來的骨缺損樣本,甲醛固定后,甲酸常規脫鈣石蠟包埋,蘇木精—伊紅(HE)切片染色,Olympus光學顯微鏡觀察觀察組織形態學變化。次要觀察指標:大體觀察:包括術后切口愈合情況、肢體活動、骨折端與材料界面及軟組織界面的情況。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析 通過改進實驗條件和術后飼養水平,合理改進實驗時間,家兔均成活至實驗要求時間。納入實驗動物 20只,進入結果分析 20只。傷口均Ⅰ期愈合,雙側觀察指標均大體相同。

2.2 大體觀察 實驗組:術后第 2周:手術傷口生長良好,無炎性反應。處死后取材觀察骨缺損表面,見植入材料表面有纖維組織膜覆蓋,與周圍組織界限仍然較清晰,接觸較好,無炎癥反應。第 4周:手術切口已經完全愈合。處死后取材見植入材料顏色較之前變淡,與周圍骨組織界限已經模糊,較第 2周時與骨缺損區結合緊密,無炎癥反應表現。第 8周:手術切口已正常。處死后取材見植入材料顏色較之前變淡,植入物材料的硬度與周圍骨組織的硬度已接近,缺損周圍有大量骨痂生成,大體觀察骨缺損已明顯減小。第 12周:處死后取材見骨缺損區已骨性愈合,未見纖維組織長入,有血管孔生成。空白對照組:第 12周:軟組織增生充填覆蓋骨缺損,未形成骨性愈合。標本剖面見骨缺損髓腔形成空腔,髓腔兩端封閉,未有新生骨長入。

2.3 X線檢查 實驗組:術后第 2周:骨缺損區密度輕度增高,但仍較清楚。骨折斷端周圍有毛玻璃樣骨組織形成。第 4周:骨缺損面積減少,骨痂密度增高,呈云霧狀,骨痂基本能將缺損處充填,骨缺損區基本上已模糊。第 8周:骨缺損區密度較之前明顯增高,骨折周圍界限模糊。第 12周:缺損區已經基本愈合,密度稍降低,骨缺損邊界已看不清。空白對照組:第 12周:缺損區邊界硬化,境界清晰,缺損區密度不均勻。

2.4 組織學觀察 實驗組:術后第2周:HE切片見大量的骨髓基質細胞形成,無明顯的炎癥反應。成骨活躍,新生骨基質周圍包繞著大量成骨細胞,可見片狀、條索狀、網狀的新生骨基質。第 4周:新骨形成明顯增多。大量的網狀編織骨形成,鈣化比第 2周明顯較強,大量的成骨細胞包埋在骨陷窩中成為骨細胞。膜性成骨及軟骨內成骨均可見。新形成的骨開始早期塑形改變,可見破骨細胞。第 8周:編織樣骨組織進一步成熟,骨小梁趨于有序性,纖維的排列方向表現出負荷的適應性改建。第 12周:新生骨組織進一步成熟,表現為松質骨逐漸向密質骨的改建,出現板層骨結構,可見小血管,骨創邊緣與原有正常骨組織相接,表現成骨的連續性。空白對照組:第 12周:髓腔無明顯成骨現象,大量纖維組織及炎癥細胞浸潤,骨折斷端未愈合。

3 討論

本實驗從大體觀察、X線片攝片、組織學 3個方面評價了新型骨修復材料的骨修復效果。大體觀察此種硬組織修復材料的標本在各個時間點均具有良好的成骨效果,骨痂形成,表面硬化,12周時表面已形成骨連接,并見骨的滋養血管長入。而對照組 12周時表面有纖維組織覆蓋,剖面圖見骨髓腔硬化封閉形成空腔,未有新骨形成。X線片證明,實驗組每個時間點都有骨痂形成,骨缺損區形成毛玻璃樣模糊影,且隨著時間的推移,骨缺損區的邊界越模糊,到 12周時已經不能看到缺損,符合大體觀察標本所看到的情況。而對照組骨缺損區 12周時周圍骨皮質硬化,缺損清晰,表明未有新生骨形成,骨缺損未得到有效修復。組織學觀察術后不同時期染色切片,隨著骨修復的進程,實驗組材料含無機材料較多,制片過程中在甲酸的作用下已經溶解,周圍有新鮮骨小梁形成,12周時骨小梁重建排列有序,板狀骨形成,而對照組斷端有大量纖維結締組織及炎性細胞浸潤,骨折斷端封閉,新骨形成少,未形成骨性連接。

本研究通過以上 3個方面,表明 AG-HA復合材料可以促進骨缺損的修復。其可能的機理如下:實驗材料是通過 AG與 HA的復合,在堿性條件下,HA晶體在 AG的調控下重新生長,獲得的新型有機—無機納米復合物。AG是一種多糖且親水的膠體,加熱使其部分醛的結構被氧化,形成羧基,其中的硫酸根、以及形成的羧基,可以與溶液中的 Ca2+發生鍵合反應,在過飽和的鈣磷溶液中,介導 AG的成核、生長。可以作為 HA晶體生長的模板,類似骨組織中膠原蛋白等調控 HA晶體的生長。同時取代物的類型、數量、位置將會嚴重影響到 AG的物理性質和功能[4]。由于 HA的引入,這種連接點區域可能被破壞,使凝膠形成了相對較弱的網狀結構。這導致反應結束,溫度降至室溫后,復合物膠凝強度降低。另外,p H通過影響多糖分子間氫鍵形成也導致瓊脂凝膠性的破壞[5],使納米 HA晶體能分布均勻,復合物的強度和結構發生改變。納米的 HA晶體與天然的 HA結構類似[6,7],為納米級的、低結晶的含碳酸根的 HA晶體,晶粒發育不完善。HA作為人體骨骼最理想的替代材料,其晶粒越細,生物活性越高。通過掃描電鏡和透射電鏡可觀察到 AG-HA復合物上有大量納米級 HA晶體,具有疏松多孔的結構,這種結構非常有利于細胞的黏附和生長。在與骨基質細胞共培養中也顯示了良好的細胞相容性。

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