辛伐他汀抑制大鼠急性心肌梗死后炎癥因子的實驗研究

顧永林,庹 田

(廣安市人民醫(yī)院心內科,四川 廣安 638000)

急性心肌梗死后交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活,心肌細胞壞死、纖維化,心肌細胞及間質增生肥大、膠原沉積致心肌重塑與心功能異常,研究表明細胞分子在其中扮演重要角色[1,2]。抑制急性心肌梗塞后炎癥因子表達,是改善或逆轉心臟重塑、保護心血管功能的重要環(huán)節(jié)。他汀類降脂藥具有降脂外的多種心臟保護作用[3,4],其可能是在分子水平上通過抑制細胞炎癥因子表達而發(fā)揮效應機制,本實驗旨在用辛伐他汀干預大鼠急性心肌梗死模型,觀察其是否具有抑制急性心肌梗死后多種炎癥因子表達、心肌膠原生成的作用,探討是否有利于改善心室重塑和心功能,為臨床利用辛伐他汀治療急性心肌梗死提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑:辛伐他汀(20mg/片)默沙東公司贈送,羥脯氨酸測定試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠心肌組織TNF-α、IL-6和 IL-10 ELISA檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。實驗操作、數(shù)據(jù)測量和分析均在重慶醫(yī)科大學臨床學院心血管實驗室完成。

1.2 動物模型的建立及分組:參照文獻的方法[5]:麻醉動物開胸,在左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部約 3mm處,結扎左冠狀動脈前降支。體重200-250克的雄性 Wistar大鼠 24只(購于第三軍醫(yī)大學動物中心),隨機分為 3組(n=8)分別為假手術組(S組),心肌梗死組(M組);心肌梗死 +辛伐他汀組(X組):辛伐他汀 40mg?kg-1? d-1,所有藥物經(jīng)灌飼法喂給,M組大鼠用生理鹽水模擬灌飼,8周后摘取心臟,送液氮保存。

1.3 心臟重量指數(shù)測定:洗凈心臟,沿室間溝切開左室(包括室間隔),右室,吸干水分,用 FA1104電子天平測量各部分重量。然后據(jù):左室心臟重量指數(shù) =左室心臟重量(mg)/體重(g)、右室心臟重量指數(shù) =右室心臟重量(mg)/體重(g)計算出左右室心臟重量指數(shù)。

1.4 心肌羥脯氨酸含量和膠原含量測定:以考馬斯亮蘭法測定心肌蛋白含量:稱取待測左室非梗死區(qū)心肌組織,按重量體積比加生理鹽水配制成 10%的組織勻漿,離心后取上清配制成 2%勻漿;取 2%組織勻漿液 0.05ml,測各管吸光度(OD值),根據(jù)公式計算蛋白含量。按操作方法將 2%組織勻漿液混勻、水浴、離心后吸取上清液測各管吸光度(OD值)。根據(jù)空白管、標準管、樣品管吸光度和標準品濃度計算心肌羥脯氨酸含量、心肌膠原含量。

1.5 心肌組織內 TNF-α、IL-6和 IL-10含量的測定:8周后留取心臟標本(非梗死區(qū)心肌組織和左室冠狀面梗死區(qū)中部心肌組織分別保存),-80℃保存。冰浴快速勻漿提取蛋白質,-20℃保存。以改良的 Lowry法測定蛋白。TNF-α、IL-6和IL-10表達依據(jù)試劑盒操作要求采用夾心ELISA法測定。

1.6 病理形態(tài)學分析:①石蠟包埋:在左室冠狀面梗死區(qū)中部,切取厚約 2-3mm的環(huán)狀心肌組織塊,4%多聚甲醛(磷酸鹽緩沖液配制)固定,石蠟包埋切片,切片厚度 3-4μm。②HE染色:切片二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木素 -伊紅染色,中性樹膠封片,普通光學顯微鏡觀察心肌組織結構。

1.7 統(tǒng)計學處理:數(shù)值采用均數(shù) ±平均差(-x±s)表示。采用 SAS6.12統(tǒng)計軟件分析,兩組間行 t檢驗,多組間用方差分析作 q檢驗。p＜0.01或 p＜0.05為差異具統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 組織形態(tài)學改變:切片 HE染色顯示:S組心肌細胞排列整齊,有少量炎性細胞浸潤,無心肌細胞壞死、無間質增生(圖 1A箭頭所示);M組梗死區(qū)心肌細胞數(shù)量減少,結構紊亂、梗死區(qū)由膠原組織代替,有大量炎性細胞浸潤,非梗死區(qū)心肌細胞代償性肥大,間質增生、膠原堆積(圖 1B箭頭所示)。X組與 M組比較,心肌細胞變性壞死減輕,炎性細胞浸潤減少,非梗死區(qū)心肌細胞的代償性肥大、間質增生、膠原堆積較 M組低(圖 1C箭頭所示)。

2.2 辛伐他汀對心室重塑的影響:M組與 S組相比,左室重量指數(shù)(LVWI)、右室重量指 (RVWI)升高 (p＜0.01);與 M組相比,X組降低 LVWI、RVWI(p＜0.01),見表 1。

表1 辛伐他汀對左室重塑的影響(x-±s)

2.3 辛伐他汀對心肌 TNF-α、IL-6和 IL-10含量的影響:M組與 S組相比,梗死區(qū)(左室冠狀面梗死區(qū)中部心肌組織)及非梗死區(qū) TNF-α、IL-6含量均升高 (p＜0.01),IL-10含量下降,尤其以非梗死區(qū)升高更明顯;與 M組相比,X組梗死區(qū)TNF-α、IL-6和 IL-10含量無明顯差異 (p＞0.01),非梗死區(qū) TNF-α、IL-6含量明顯降低(p＜0.01),IL-10含量則升高(p＜0.05),見表 2。

-±s)

表2 辛伐他汀對 TNF-α、IL-6和 IL-10含量的影響(x

2.4 辛伐他汀對心肌羥脯氨酸及膠原含量的影響:心肌梗死后 8周,M組大鼠心肌膠原含量(40.58±4.31)mg/g高于對 S組(15.65±2.60)mg/g(p＜0.01)。與 M組相比,X組心肌膠原則含量降低至(24.95±5.74)mg/g(p＜0.01)。M組非梗死區(qū)心肌羥脯氨酸為(5.528±0.59)mg/g干重,高于假手術對照組(2.132±0.35)mg/g干重,X組非梗死區(qū)心肌羥脯氨酸含量為(3.40±0.78)mg/g干重,較 M組降低 22.7%。

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計,平均每 12秒就有一人死于心血管疾病,其中心肌梗死占一半以上;心肌梗死的再發(fā)率、致殘率都很高,也是導致心梗心力衰竭的主要原因之一;65歲以下有急性心肌梗死病史患者近一半在8年內死亡[6]。心肌梗死后心室重構是決定心肌梗死(MI)患者心功能及預后的主要因素。心室重構包括心肌細胞形態(tài)、結構及數(shù)量分布的改變。近年來,他汀類藥物具有改善心肌細胞功能、抑制炎癥因子表達等多種降血脂以外的心血管保護作用[7],對缺血性心力衰竭治療效果顯著。

心肌梗死后機械牽張及神經(jīng)激活致 IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TGF等細胞因子分泌增多,可以通過激活基質金屬蛋白酶等許多途徑導致心肌膠原沉積、心肌纖維化,是導致心肌進行性重構的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)[8],IL-6在心肌慢性重構階段表達也增加,升高程度與非梗塞區(qū)隨后的膠原沉積程度一致,促進了非梗塞區(qū)心肌組織間質纖維化和膠原沉積;IL-6也可介導免疫和炎癥反應,在導致斑塊破裂而誘發(fā)急性心肌梗死或急性冠脈綜合征中起了重要作用。

其他研究表明他汀類藥物也具有直接抑制膠原合成及其 mRNA表達,減輕膠原沉積[9];可以抑制心肌基質金屬蛋白酶(MMPs)激活的作用,從而發(fā)揮改善心肌間質重構的作用。氟伐他汀治療能夠顯著降低非梗死區(qū)的 MMP-2、MMP-13的水平,增加非梗死區(qū)心肌的 TIMP-2的水平,從而逆轉 MI后的左室重塑。他汀類藥物也阻斷參與心肌細胞肥大的 RAS細胞內信號傳導,達到抑制心肌肥大、改善左室重塑。他汀類甚至可以提高心肌內皮型NOS(eNOS)活性、增加 NO的釋放,改善內皮功能,延緩或可能阻止動脈粥樣硬化進程,改善心肌缺血誘發(fā)的心臟功能障礙和心肌纖維化[10]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn):心梗組大鼠心肌羥脯氨酸及膠原含量明顯升高,左右室重量指數(shù)也升高,表明心梗模型成功,發(fā)生了心肌纖維化及心室重構。辛伐他汀明顯減少心肌非梗死區(qū) IL-6、TNF-α表達,部分增加 IL-10表達,減少了心肌羥脯氨酸和膠原含量,抑制心肌梗死后纖維化,同時改善急性心肌梗死后心室重塑和心臟功能,表明辛伐他汀的非降脂心臟保護機制可能與降低 IL-6、TNF-α表達,增加 IL-10表達,抑制心肌纖維化有關,發(fā)揮他汀類藥物對心肌結構和功能的保護作用。我們的試驗與這些研究結果一致。

總之,本實驗證實辛伐他汀干預可降低 IL-6、TNF-α表達,增加 IL-10表達,這可能是辛伐他汀抑制心肌梗死后心肌膠原沉積、心肌纖維化,改善心室重塑和心臟功能的機制之一,但深入的其他機制尚待進一步探討。

[1] Rogers TB.Angiotension signal transduction pathway in thecardiovascular system[J].Trends CardiovascMed,1994,38(4):110-113

[2] 田鳳石,李 旸,胡大一,等 .急性心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛患者黏附分子及相關因素的研究[J].中華老年心腦血管病雜志,2001,3(5):301-303

[3] 趙 鋼,劉閨男,李志明 .阿托伐他汀對 LPS誘導人血管內皮細胞IκBα表達的影響[J].中國藥理學通報,2007,23(3):395-399

[4] Su SF,Hsiao CL,Chu CW,et al.Effectsof Pravastatin on left ventricularmass in paiients with hyperlipidemia and essential hypertension[J].Am JCardiol,2000,86(5):514-518

[5] 覃 數(shù),陳運貞.大白鼠實驗性心肌缺血再灌注模型制備與心電圖改變的特點[J].重慶醫(yī)科大學學報,1998,23(1):8-11

[6] 吳兆蘇 .膳食營養(yǎng)與心腦血管病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.7-14

[7] 羅順祥,洪華山.心肌梗塞非梗塞區(qū)心肌重構中炎癥反應的研究進展[J].心血管康復雜志.2006,15(2):199-201

[8] Zhang J,Cheng X,Liao YH,et al.Simvastatin regulatesmyocardial cytokine expression and improves ventricular remodeling in rats after acutemyocardial infarction[J].Cardiovasc Drugs Ther,2005,19(1):13-21

[9] Martin J,Denver R,Bailey M,et al.In vitro inhibitory effects of atorvastatin on cardiac fibroblasts:implications for ventricular remodelling[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2005,32(9):697-701

[10] Lin MS,Chou TF,Chang NC.Additive effectsofcombined blockade ofAT1 receptor and HMG-CoA reductase on leftventricular remodeling in infarcted rats[J].Am JPhysiolHeart Circ Physiol,2006,291(3):1281-1289