乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的研究進(jìn)展

■ 劉先 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) ■ 康小紅 齡南 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司

按照組成的不同，乳酸菌（lactic acid bacteria，縮寫為LAB）產(chǎn)生的胞外多糖（exopolysaccharides，縮寫作EPS）可以分為3類：①葡聚糖類，即右旋糖苷、改性葡聚糖及變異聚糖；②果聚糖類，如左聚糖；③由嗜溫乳酸菌及嗜熱乳酸菌產(chǎn)生的雜多糖類。在過去，人們對黏乳酸菌的興趣與日俱增，比如乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp.cremoris）、乳酸乳球菌乳亞種（L.lactis subsp.lactis）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbreuckii subsp.bulgaricus）以及唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus aslivarius subsp.thermophilus）等。由于這些細(xì)菌具有公認(rèn)的安全（generally recognized as safe，縮寫為GRAS）性，所以它們產(chǎn)生的EPS被廣泛地用作食品工業(yè)中的增稠劑、凝膠劑以及穩(wěn)定劑。

1 EPS的生物合成途徑

因菌種不同，乳酸菌EPS的合成會發(fā)生在生長的不同階段。按合成位點(diǎn)和模式不同，乳酸菌EPS的生物合成分為2種類型，即位于細(xì)胞壁外的同源多糖（homopolysacchride）的合成和位于細(xì)胞膜上的異源多糖（heteropolysaccharide）的合成。

1.1 同源多糖的生物合成

同源多糖（如葡聚糖、果聚糖）是在胞外合成的。合成體系包含糖基供體（蔗糖）、糖基受體及葡聚糖蔗糖酶（dextransucrase）。

腸膜明串珠菌在合成葡聚糖的過程中，在葡聚糖酶的作用下，將培養(yǎng)基中蔗糖轉(zhuǎn)移到前體物質(zhì)的非還原性末端上，其合成過程如下：

葡聚糖合成的過程屬于單鏈反應(yīng)機(jī)制，以蔗糖為唯一底物，合成所需的能量來自于蔗糖的水解，而不是糖基－核苷酸，不需脂載體和獨(dú)立的分支酶。葡聚糖蔗糖酶是一個核苷轉(zhuǎn)移酶，能將供體的糖基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體（即正在延長的糖基鏈）上，蔗糖可啟動其自身的多聚化反應(yīng)。

1.2 異源多糖的生物合成

細(xì)菌異源多糖的合成體系包含5個因子：糖基—核苷酸、酰基供體、脂中間體、酶系統(tǒng)及糖基受體。在細(xì)胞膜上合成多糖需要活性前體，即：①各種高能態(tài)的單糖，這些高能態(tài)的單糖主要是糖基—二核苷酸，所有含葡萄糖的多聚物（除糖源外）均以UDP－D－葡萄糖為供體；②乙酸、丙酮酸、3－羥基丁酸等的活性形式，為胞外多糖合成所必需的；③異戊二烯脂；④酶系統(tǒng)，包括己糖激酶、糖基—核苷酸合成酶及轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等。目前對乳酸菌異源多糖的合成了解甚少。

2 EPS產(chǎn)量的影響因素

2.1 培養(yǎng)條件

除菌株（種）外，培養(yǎng)溫度、pH值以及發(fā)酵時間等因素都會在很大程度上影響乳酸菌EPS的產(chǎn)量。

2.1.1 溫度

培養(yǎng)溫度不同，EPS的產(chǎn)量差別很大。Carcia Caribay和Marshall發(fā)現(xiàn)，在脫脂乳中，與32～37℃最適生長的溫度相比，徳氏乳桿菌保加利亞亞種NCFB2772在48℃時能夠產(chǎn)生較多的特定聚合物。Crobben等利用相同的菌株檢測EPS的產(chǎn)量時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度較高（45℃）時，德氏乳桿菌保加利亞亞種NCFB2772在確定性培養(yǎng)基中也能產(chǎn)生大量特定聚合物。Mozzi等發(fā)現(xiàn)了CRL870菌種最適生長溫度（37～42℃）與最大EPS產(chǎn)量之間的關(guān)系。

相反，德氏乳桿菌保加利亞亞種RR菌株在低于最適生長溫度的條件下，能夠形成較高量的EPS聚合物。Kojic等研究了干酪乳桿菌CC11（Lactobacillus casei CC11）的情況，與25℃的培養(yǎng)溫度相比，在30℃的培養(yǎng)條件下，干酪乳桿菌CC11產(chǎn)生的EPS量明顯降低，約下降50%。他們認(rèn)為，較低的培養(yǎng)溫度能夠提高乳酸菌EPS的產(chǎn)量，但是，如果培養(yǎng)溫度過低，乳酸菌的生產(chǎn)速度就會減慢，導(dǎo)致細(xì)胞生長量降低，從而使EPS的產(chǎn)量有所降低。表1列出了不同培養(yǎng)溫度下清酒乳桿菌細(xì)胞生長率、細(xì)胞最大干重（drwmax）與其EPS間的關(guān)系。從表1可以看出，清酒乳桿菌0-1產(chǎn)EPS的最適溫度是20℃。

2.1.2 pH值

培養(yǎng)基的起始pH值以及在培養(yǎng)過程中對pH值的控制，都會影響EPS的最終產(chǎn)量。選擇最佳的起始pH值條件，可以使EPS的產(chǎn)量更高。

從表2可以看出，嗜熱鏈球菌（Stretococcus thermopholus）S22在以乳糖作為碳源的培養(yǎng)基中，當(dāng)起始pH值為7.0時，其產(chǎn)生的EPS量比起始pH值為5.5時要多。在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，無論是在10℃還是42℃，當(dāng)起始pH值為5.5時，其EPS的產(chǎn)量比起始pH值為7.0時高。

在乳酸菌EPS生產(chǎn)發(fā)酵中，選擇適宜的起始pH值，并在培養(yǎng)過程中進(jìn)行適當(dāng)?shù)乜刂疲瑢蠓鹊靥岣逧PS的產(chǎn)量。

2.1.3 發(fā)酵時間

不同的生長階段，乳酸菌菌株產(chǎn)EPS的量亦不同。表3表明，與對數(shù)生長期相比，徳氏乳桿菌保加利亞亞種的2個菌株在穩(wěn)定期能夠產(chǎn)生更多的EPS。研究表明，嗜熱鏈球菌菌株S22在對數(shù)生長期間（0～6h）并不產(chǎn)生EPS，培養(yǎng)10h后開始產(chǎn)生EPS，當(dāng)生長到14～18h時，EPS的產(chǎn)量最大。干酪乳桿菌CC11在穩(wěn)定期仍能繼續(xù)產(chǎn)生EPS，接種72h后，CC11菌株產(chǎn)生的EPS量比接種48h后要高30%～50%。干酪乳桿菌干酪亞種NCIB4114（L.casei subsp.caseiNCIB4114 ）接種48h后，EPS的產(chǎn)量為55mg/L，而接種120h后，EPS的產(chǎn)量為105mg/L。研究表明，隨著接種時間的延長，EPS的總量會降低。例如，清酒乳桿菌0-1隨著生長的結(jié)束，其EPS的產(chǎn)生停止。顯然，除了菌株（種）的影響外，發(fā)酵時間的長短對EPS的產(chǎn)量也有一定的作用。目前，許多研究傾向于EPS的產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而降低，可能與酶降解或培養(yǎng)基物理參數(shù)的改變有關(guān)。

表1 清酒乳桿菌0-1生長溫度對EPS產(chǎn)量的影響

表2 嗜熱鏈球菌S22的EPS產(chǎn)量與起始pH值的關(guān)系

表3 德式乳桿菌保加利亞亞種不同生長階段的EPS產(chǎn)量（42℃，pH值為6.0）

2.2 金屬離子和化學(xué)試劑

酶在乳酸菌的EPS生物合成中起著重要的作用，它們的活性也受許多因素的影響。例如，人們已經(jīng)從鼠李糖乳桿菌菌株R的EPS合成中提取了糖原水解酶（glycohydrolase），該酶含有2個組分，即α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸糖苷酶。研究表明，α-葡萄糖苷酶在Li+、Na+、K+、Ca2+、Co2+、Mg2+作用下活性有所提高，Hg2+、Mn2+、Cu2+和Fe2+可完全抑制α-葡萄糖苷酶的活性，而Zn2+只對α-葡萄糖苷酶活性有輕微的抑制作用（表4）。當(dāng)Mn2+存在時，β-葡萄糖醛酸糖苷酶的活性完全受到抑制；而當(dāng)Hg2+和Fe2+存在時，這種酶分別保留了19%和60%的活性；當(dāng)Cu2+存在時，β-葡萄糖醛酸糖苷酶可保持72%的活性；其他金屬離子對其活性幾乎沒有影響。進(jìn)一步的研究表明，尿素和DDT可抑制α-葡萄糖苷酶的活性。如果培養(yǎng)液中含有2-巰基乙醇時，則α-葡萄糖苷酶可以保持95%的活性，這意味著巰基組分對α-葡萄糖苷酶上的活性位點(diǎn)會產(chǎn)生影響。2-巰基乙醇的存在能輕微激活β-葡萄糖醛酸糖苷酶的活性，且β-葡萄糖醛酸糖苷酶的活性不受尿素的影響，但DDT會抑制β-葡萄糖醛酸糖苷酶的活性。此外，EDTA對這2種酶的活性均有一定的抑制作用。

表4 陽離子和化學(xué)試劑對鼠李糖乳桿菌R菌株中部分純化的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸糖苷酶活性的影響

3 EPS的純化及功能性能的研究

3.1 EPS的分離純化

多糖的分離純化，由其性質(zhì)和共存的組成成分來決定。通常先用離心法去除蛋白質(zhì)和細(xì)菌體，然后用乙醇或丙酮分級沉淀EPS，并用透析法去除共同沉淀的無機(jī)鹽。平均分子量很高的EPS，可以通過填充低孔性凝膠的色譜柱進(jìn)行脫鹽。有時EPS結(jié)合部分蛋白質(zhì)，可用酶（如胃蛋白酶和胰蛋白酶）去除，也可用Savage方法去除締合蛋白質(zhì)，并用掃描法鑒定蛋白質(zhì)脫除效果。可采用凝膠色譜法進(jìn)行粗多糖的分級純化。多糖的純度鑒定，可用葡聚糖凝膠電泳、高壓電泳法和超速離心法等。

3.2 乳酸菌EPS的生理功能特性

自有報道乳酸菌EPS具有抗腫瘤作用后，引起了許多學(xué)者的廣泛關(guān)注。從目前報道的研究結(jié)果來看，乳酸菌EPS主要有以下幾方面的功能。

3.2.1 改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)

David等發(fā)現(xiàn)，利用產(chǎn)EPS的乳酸菌可提高M(jìn)ozzarella干酪的水分含量，提高干酪的得率；Rawsom等的研究結(jié)果認(rèn)為，利用產(chǎn)EPS的嗜熱乳酸菌生產(chǎn)發(fā)酵乳，可以改善攪拌型酸乳的組織狀態(tài)，防止乳清分離，無須添加穩(wěn)定劑。

3.2.2 改善菌株對腸道黏膜的吸附

各類細(xì)菌的腸道粘附基本分為2步：第一步是非特異性的，該過程是由菌體結(jié)構(gòu)特異性決定的；第二步是在特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上，菌體的特異性配體進(jìn)一步與宿主細(xì)胞相應(yīng)的受體之間特異性結(jié)合。EPS可以提高菌株對腸道表面的非特異性粘附。

3.2.3 抗腫瘤作用

目前認(rèn)為，乳酸菌EPS抗腫瘤作用可能有下述幾方面的機(jī)制：①影響血液供應(yīng)。鑒于細(xì)菌素能引起腫瘤細(xì)胞出血性壞死，曾經(jīng)設(shè)想多糖的抗腫瘤作用可能影響腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)。②對細(xì)胞體積和空胞化的影響。多糖分子可以從腹膜腔吸附進(jìn)入血液循環(huán)，然后活化多糖分子，其活化的部分?jǐn)U散回腹腔膜內(nèi)以直接影響腫瘤細(xì)胞。③多糖分子或其一部分可能刺激一種器官或組織（如腎上腺和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)）分泌某種物質(zhì)作用于腫瘤細(xì)胞。④細(xì)胞膜接觸抑制的功能。體內(nèi)和體外試驗表明，DEAE-右旋糖酐對于腫瘤腹水細(xì)胞均有抑制效應(yīng)。⑤對免疫系統(tǒng)的促進(jìn)作用。Gomez等從青春雙歧桿菌ATCC15703培養(yǎng)基的上清液中分離得到的胞外物質(zhì)，能誘導(dǎo)鼠肝細(xì)胞的誘變活性，從胞外物質(zhì)中分離得到EPS，對鼠的移植腹水腫瘤180具有抗腫瘤活性。由高加索乳桿菌和糞便菌株產(chǎn)生的Kefiran，能提高腫瘤鼠的遲發(fā)型過敏性應(yīng)答。多糖免疫活性的提高，是通過T細(xì)胞誘導(dǎo)的，而不是B細(xì)胞。詳細(xì)機(jī)制可能與多糖的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，多糖通過多種途徑增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力，如產(chǎn)生刺激細(xì)胞因子，競爭性拮抗免疫抑制因子等。⑥對細(xì)胞體的保護(hù)作用。莢膜和黏液多糖的生理功能主要是起防護(hù)作用，適當(dāng)保持水分，吸收金屬離子，并可能具有抑制溶菌酶和防御噬菌體的作用。

4 結(jié)語

目前，對大多數(shù)乳酸菌胞外多糖而言，轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)成本相當(dāng)高，要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還有待進(jìn)一步的研究。現(xiàn)階段國內(nèi)外有關(guān)EPS的研究主要集中于影響EPS的生物合成條件。不同乳酸菌菌株產(chǎn)生的EPS量不同，其形成的多糖種類也有差別。培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分及相關(guān)酶類都可以影響乳酸菌產(chǎn)EPS的量。因此，必須提高發(fā)酵技術(shù)，在了解EPS表達(dá)環(huán)境和機(jī)理的基礎(chǔ)上，通過特定條件，運(yùn)用基因工程手段和酶技術(shù)來提高乳酸菌EPS的產(chǎn)量和質(zhì)量。