m icroRNA在大鼠急性心肌梗死模型的差異表達及其功能分析

施冰,米林,王娟,崔慶華,郭艷紅,于海弈,高煒

(1.北京軍區總醫院干部病房一科,北京 100700;2.北京大學基礎醫學院醫學信息學系;3.北京大學第三醫院心內科)

越來越多的證據表明,microRNA(miRNA)在很多重要的生命過程中(如細胞生長、組織分化、細胞增殖、胚胎發育以及細胞凋亡等)起著關鍵作用。急性心肌梗死是嚴重威脅人類健康的疾病,及時診斷和治療對患者的生活質量有重要影響。本研究采用 microarray篩選與急性心肌梗死相關的 miRNA,用生物信息學方法分析了 miRNA的轉錄因子和靶基因的功能,探討其與急性心肌梗死發生發展的關系,以其為闡明早期發現心肌梗死的生物標記物提供新的依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 大鼠急性心肌梗死模型的制備 雄性清潔級SD大鼠(180 g),復合麻醉劑行腹腔注射麻醉,固定于手術臺上,四肢皮下連接心電圖電極,記錄標準導聯心電圖,胸骨上窩上正中切開皮膚,向下鈍性分離推開下頜下腺,使氣管充分顯露,于第 2～3氣管環間行氣管橫行切開,插入氣管插管(用套管針自制),連接動物呼吸機進行人工控制呼吸。順肋間隙方向于胸骨左旁第 3～4肋間切開皮膚,逐層分離皮下組織、肌肉,于 3～4肋骨間撐開進胸,暴露心臟,在左心耳下緣與肺動脈圓錐間可以看見左冠脈前降支起始部,用 6～0線縫針穿過左冠狀動脈前降支,連同一小束心肌一起結扎,結扎后左室壁變蒼白,并出現室壁運動減弱。心電監護可見Ⅱ導聯 ST段明顯抬高,證實模型制作成功。觀察 10 min后徹底止血,逐層關胸?；謴痛笫笞灾骱粑?撥出氣管內插管,縫合氣管切口和頸部切口。假手術組除縫線不結扎外,其他制作程序與心肌梗死模型組完全相同。

1.2 RNA提取和芯片檢測

1.2.1 總 RNA抽提 采用液氮研磨法將 100 mg缺血區心肌組織磨成粉末,加入 1ml Trizol混合,按trizol說明抽提總 RNA。

1.2.2 miRNA芯片檢測 應用北京博奧公司 microarraymammalian V3.0芯片檢測(包括 924條探針,針對人、大鼠、小鼠的成熟 miRNA,及預測的miRNA)。為保證結果的重復性和可靠性,每個實驗組用三張芯片進行試驗,每張芯片重復 l次.用Significance Analysis of Microarrays(SAM,version 3.0)軟件挑選差異表達基因。用 Cluster 3.0對差異表達 miRNA進行聚類分析。

1.2.3 應用 qRT-PCR驗證差異表達的 miRNA 應用 stem-loop RT引物進行RT反應。PCR擴增條件:95℃,15 s,60℃,30 s,40個循環;75℃至 95℃繪制溶解曲線,非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴增情況。

1.3 m iRNA的靶基因/轉錄因子預測和功能分析

1.3.1 miRNA靶基因的預測 目前預測 miRNA靶基因的常用數據庫有:① miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/);②TargetScan(http://targets-can.org/index.htm l/);③PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new PicTar-vertebrate.cgi);④miRanda(http://m icrorna.org/microrna/home.do)。由于 miRNA與靶 mRNA的互補性不高,在進行預測時僅僅依賴 6～8個堿基之間的互補。因此,預測結果可能會有一定的假陽性。為了克服這一不足,我們同時利用上述 4個數據庫對同一 miRNA的靶基因進行交叉預測,這樣既提高了預測的準確性,也縮減了靶基因的數量,節省了實驗驗證的工作量。

1.3.2 miRNA相關轉錄因子的篩選 miRNA是一種在轉錄后水平調節基因表達的小分子 RNA,其可與轉錄因子(TF)組成配偶體,對共同作用的靶基因進行調節,構成基因表達調控網絡。在 m iRNA-TF共同對靶基因調節作用的過程中,TF可以調節miRNA,反過來也可受到 miRNA的調節,形成多樣性的前饋環路(FFL s)。

我們通過 TransmiR[1]數據庫(TransmiR,http://cmbi.bjmu.edu.cn/transmir),篩選了與差異表達的 miRNA相關的轉錄因子。

1.3.3 功能富集分析 我們應用 EASE[2]對篩選的轉錄因子,miRNA的靶基因,m iRNA的宿主基因進行了基因功能富集分析,并利用超幾何分布假設檢驗分析了各 miRNA相關 TF的富集度,還對獲得的 P值進行了 Bonferroni多重比較校正。

2 結果

2.1 miRNA芯片檢測結果 與正常心肌組織比較,共篩選出 17個與急性心肌梗死相關的差異表達的 miRNA(上調 ＞2倍或下調 ＜0.5倍)。其中表達上調的 miRNA為 9個,分別是 m ir-31,miR-214,miR-923,miR-711,m iR-199a-3p,miR-199a-5p,mir-18a,m iR-18b。表達下調的 miRNA為 8個,分別是miR-1,miR-126,miR-29b,miR-26b,miR-451,miR-181c,miR-181d,miR-499-5p。

2.2 實時定量 RT-PCR檢測 隨機選取 4個 miRNA(miR-31,miR-214,miR-126,miR-499-5p)進行實時定量 RT-PCR驗證.擴增曲線,融解曲線及 PCR產物電泳顯示該方法具有良好的擴增效率及特異性。

2.3 實時定量 RT-PCR與 miRNA芯片結果比較參照文獻,對芯片數據及實時定量 RT-PCR數據進行歸一化處理,以使兩者具有可比性,即從 miRNA芯片得到缺血心肌與正常心肌中不同 miRNA的信號平均值,將缺血心肌的信號值除以健康對照組的信號值,得到比值 Rarray(缺血/正常對照)。定量RT-PCR計算公式 :Rpcr=EmiR-x△CP(對照-樣本)/Eu6△CP(對照-樣本),U6為內參;E表示擴增效率;CP(crossing point)表示實時熒光強度顯著大于背景值時的循環數。得到兩組比值 Rarray與 RTPCR,比值大于 1表示上調,比值小于 1表示下調,相對于 U6,miR-31,miR-214的表達在芯片和實時定量 RT-PCR均上調;miR-499,miR-126的表達在芯片和實時定量 RT-PCR均下調,結果表明實時定量RT-PCR與芯片結果相符。

2.4 m iRNA的靶基因、轉錄因子及功能分析 我們發現 17個差異表達的 miRNA中的 9個有一個或以上的靶 mRNA,共篩選了 195對 miRNA-靶基因。從 TransmiR識別了 14對試驗證明的 TF-miRNA,其中,14個 TF調節了 6個 miRNA(表 1)。

表1 試驗證明的TF-m iRNA

這些結果提示缺血心肌中差異表達的 miRNA趨向于通過和心血管功能相關的轉錄因子和靶基因配對而在心血管疾病中發生作用。

絕大多數 miRNA在基因組上的位置是位于一個編碼基因的內含子(intron)里,此類 miRNA叫做內含子miRNA(intronicmiRNA)。有報道表明內含子miRNA往往和宿主基因共表達[3-4],則內含子 miRNA和其宿主基因就有比較高的概率功能相關。因此可以通過了解其宿主基因的功能以及所參與的疾病預測該 miRNA可能的功能以及可能參與的疾病。

我們分析了 17個差異表達的 miRNA的宿主基因的功能,發現其中 7個 miRNA坐落在蛋白編碼基因的內含子(表 2)。宿主基因的功能富集分析沒有發現富集的功能,可能是由于樣本量太小的原因(僅分析 7個宿主基因)。其次,我們分析了宿主基因的功能,發現 6個 miRNA的宿主基因的功能與心血管疾病相關。microRNA的這些特性進一步說明miRNA可能成為急性心肌梗死的生物學標記物和治療靶點。

表2 內含子m iRNA及其宿主基因的功能

3 討論

miRNA的表達具有組織特異性和時序性。對于差異表達的 miRNA的組織特異性分析,我們發現平素在心肌組織中特異性高表達的 miR-1和 miR-499-5p在缺血心肌中表達顯著下調。而非心肌組織特異性表達的 miR-31和 miR-214在心肌梗死后缺血心肌中表達上調。提示心肌組織特異性 miRNA可能成為心肌梗死的新的生物標記物。

對 miRNA的轉錄因子靶基因及其宿主基因的功能分析發現,缺血心肌中差異表達的 miRNA趨向于通過和心血管功能相關的轉錄因子和靶基因配對而在心血管疾病中發生作用。這些結果進一步提示miRNA可能成為心肌梗死的新的生物標記物和治療靶點。

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