夾脊電針治療對大鼠神經根型頸椎病模型丘腦痛感區 FOS蛋白及脊髓背角COX-2蛋白含量的影響

高曦,李倩,張海兵,李登宇,孫忠人

(黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040)

夾脊電針治療神經根型頸椎病有著可靠地臨床鎮痛療效,且無明顯不良反應。但我們發現對夾脊電針治療神經根型頸椎病根性痛的機制尚不明確,給治療方法的臨床推廣帶來了諸多的困難。

本實驗旨在探討夾脊電針對頸神經根炎的頸椎病模型大鼠的丘腦痛感區 FOS蛋白及脊髓背角COX-2蛋白含量表達的影響,為從分子生物學角度,明確夾脊電針針刺效應與中樞鎮痛的關系,揭示夾脊電針治療神經根型頸椎病的鎮痛機制,為夾脊電針臨床治療神經根型頸椎病提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 取成年 Wistar大鼠 40只,體質量(300±20)g,由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。主要儀器試劑:腦立體定向儀(江灣 I型),德國萊卡 2135型切片機,美國 Moticam3000顯微攝影成像系統,上海一恒電熱恒溫箱,醫用微波爐,KWD-808I全能脈沖電療儀,免疫組織化學 FOS抗體、COX-2一抗抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與治療 將 40只大鼠隨機分為健康對照組、模型對照組、手針對照組和電針治療組,每組10只。健康對照組:正常飼養,不做任何處置。模型對照組:于造模后第 3天開始,每日抓取 1次,不做針刺處置。手針對照組:于造模后第 3天開始手針治療。電針治療組:于造模后第 3天開始電針治療。根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的動物針灸穴位圖譜[1],取雙側 C6、C7“夾脊”(位于大鼠頸椎棘突間旁開約0.5 cm處),常規消毒穴區皮膚,選用華佗牌 28號 0.5寸不銹鋼毫針,直刺進針,進針深度 0.3～0.6 cm,輕捻轉提插后,針柄接 KWD-808I全能脈沖電療儀,夾脊穴正負極左右交替聯。密波型,頻率 75Hz,電流強度以大鼠頸肌及前肢輕度抖動為度。1次/d,每次 15 min。連續治療 3周后處死。

1.2.2 動物模型的制作 各組大鼠在 10%水合氯醛 380mg/kg腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于操作臺上,頸前部墊小棉墊,以利頸椎后突,便于操作,以第七頸椎作為骨性標志,作頸部后正中切口,逐層切開皮膚、皮下組織、頸部筋膜,用骨刀緊貼棘突,鈍性剝離左側頸部肌肉達椎板,確認 C6-C7椎間隙,用止血鉗咬除左側 C6、C7部分椎板,顯露出 C7神經根,將浸有甲醛的定量濾紙片放在 C7神經根肩上,逐層縫合,關閉切口。所有操作均在無菌條件下進行,術后每只大鼠腹腔注射青霉素 1萬 u,常規飼養。

1.2.3 指標觀察及檢測

1.2.3.1 丘腦痛感受區 FOS蛋白表達的檢測 取材:在麻醉下剖開胸腔,經左心室插管至升主動脈。先快速灌注。0.9%氯化鈉溶液 100～150 ml,繼之灌注含 4%多聚甲醛的 0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)300～350 m l。立即斷頭,在腦立體定向儀(江灣 I型)上固定,參照大鼠腦立體定位圖譜[2],在丘腦范圍內(AP1.0～3.0)定位取腦組織塊,置于上述灌流液中固定 1 h,移至 20%蔗糖溶液中過夜(4℃)。以約在 AP2.2～2.3范圍內以韁核腳間束為標志冰凍切片(40μm),每塊切 6～10片。

免疫組織化學法檢測 FOS蛋白表達:組織切片收集于 0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH7.4)內 30 min,浸入含 0.2%TritonX-100的 PBS內30min,FOS抗體用血清稀釋液(1%牛血清白蛋白;0.2%TritonX-100,0.08%疊氮鈉)稀釋成 1∶500,40℃孵育 48 h,陰性對照片以正常血清代之;加二抗(Vector Lab,1∶200稀釋),室溫下反應 2 h;加 ABC(Vector Lab,1∶100稀釋),室溫下反應 1 h,DAB顯色液顯色 15～20min。各步驟之間均以0.01mol/L PBS液沖洗 3次。顯色后貼片涼干,系列乙醇脫水,二甲苯透明,封片,光鏡下觀察。每只動物隨機取 5張組織切片,在 Leica Qwin圖像分析儀上,分別計數丘腦左右韁核腳間束外側束旁核區域 FOS免疫陽性細胞數。

1.2.3.2 脊髓背角 COX-2蛋白表達的檢測 取材:將大鼠用 8%的水合氯醛 1m l麻醉,左心室插管灌注固定,先以 250 ml 0.9%氯化鈉注射溶液快速灌沖,繼之灌入 250ml含 4%多聚甲醛的 0.1 M磷酸鹽緩沖液(PBS)。灌注完畢后,剝離鼠脊髓頸膨大,置于上述固定液 4℃過夜,隨后分別浸泡在含10%,20%,30%蔗糖的 0.1MPBS中,4℃放置。在Reichert-Jung半導體致冷的切片機(德國)上制備30μm厚冰凍冠狀切片。

免疫組織化學法檢測 COX-2蛋白表達:切片收集于含 30%蔗糖、30%乙二醇的 0.05M PBS中,置-20℃保存。免疫組織化學 COX-2一抗抗體(Santa Cruz公司)稀釋度為 1∶400,染色步驟按華美ABC免疫組織化學檢測即用型試劑盒使用說明進行,用 PBS代替一抗作為陰性對照。觀察脊髓背角COX-2樣免疫反應陽性細胞數的變化,經 DAB顯色,陽性細胞呈紅棕色。以脊髓背角的 RexedⅡ層作為主要觀察部位,在 Leica Qwin圖像分析儀上計數免疫陽性細胞數。

1.2.4 統計學處理 實驗數據用 SPSS 13.0軟件進行統計學處理。兩組間比較用 t檢驗,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結果

各組大鼠光密度測定結果比較見表 1。

表1 各組大鼠光密度測定結果比較(±s)

表1 各組大鼠光密度測定結果比較(±s)

注:與健康對照組比較,a P＜0.01;與模型對照組比較,b P＜0.05,c P＜0.01;與手針對照組比較d P＜0.05

組別 鼠數(只) FOS蛋白 COX-2蛋白健康對照組 10 0.1484±0.0231 0.1637±0.0233模型對照組 10 0.2239±0.0419a 0.2501±0.0379a手針對照組 10 0.1852±0.0304ab 0.2182±0.0353a電針治療組 10 0.1581±0.0261cd 0.1859±0.0254cd

3 討論

3.1 選穴依據 中醫認為夾脊穴位于督脈與足太陽膀胱經之間,夾督脈伴太陽經而行,其定位、循行,以及作用功能與督脈和膀胱經的循行密切相關。其中,督脈能“總督諸陽”,為“陽脈之?！?督脈行于脊里,入絡于腦。足太陽膀胱經在背部的循行路線上分布著臟腑的背俞穴。通過各種方法刺激夾脊穴可以暢通督脈及太陽經氣而調和陰陽,為夾脊穴治療脊柱相關疾病提供了理論依據[3-4]。

3.2 夾脊電針治療對神經根型頸椎病大鼠丘腦痛感區 FOS蛋白及脊髓背角 COX-2蛋白含量的影響

現代研究表明,FOS蛋白是 c-fos基因的表達產物,正常生理情況下 c-fos基因在多種細胞中均有低水平的表達,參與細胞的生長、分化、信息傳遞等生理功能。其特征為當神經元受到某種刺激時,神經元胞核內的 c-fos基因可產生迅速表達,轉錄形成mRNA,進入胞漿翻譯合成分子量為 55kd的核磷蛋白,即 FOS蛋白,并且在丘腦痛感區表達顯著。因此,廣泛用于痛覺定位和神經科學中樞通路研究[5]。

脊髓 COX-2蛋白在炎癥痛的中樞敏化中起至關重要的作用。COX-2蛋白在神經元和神經膠質細胞中都有分布,外周炎癥時脊髓 COX-2的表達增加,并與神經元及膠質細胞中的興奮性氨基酸及其受體、P物質等形成中樞敏化的正反饋環路[6]。

本研究觀察了大鼠丘腦痛感區 FOS蛋白及脊髓背角 COX-2蛋白含量的表達,發現頸神經根炎大鼠,FOS蛋白、COX-2蛋白含量較健康對照組的表達明顯升高,這與以往的研究相符合。夾脊電針治療能降低神經根型頸椎病大鼠丘腦痛感區 FOS蛋白及脊髓背角 COX-2蛋白的表達,對神經根組織具有保護作用。

[1] 華興邦.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,(1):1-5.

[2] 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛生出版社,1994:57-64.

[3] 安光輝,趙毅,孫鵬.夾脊穴治療頸椎病的理論與應用[J].中國臨床康復,2006,10(31):130.

[4] 李金虎.活血止痛膠囊結合推拿治療神經根型頸椎病32例療效觀察[J].中國臨床保健雜志,2008,11(4):408-409.

[5] 方向義,胡海濤.中樞神經系統fos蛋白的表達與外周傷害性刺激[J].神經解剖學雜志,1996,12(3):281-283.

[6] 方劍喬.環氧合酶-2在炎癥疼痛中的表達及電針干預的可能性[J].浙江中醫學院學報,2002,26(2):51.