水稻矮稈基因定位和克隆的研究進(jìn)展

詹慶才,肖子發(fā)

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省水稻研究所生物技術(shù)研究室，湖南 長沙 41025）

1 水稻矮稈性狀的研究現(xiàn)狀

水稻諸多性狀中，矮稈是研究最早和最多的性狀之一，水稻的半矮稈化也是育種最重要的成果之一。20世紀(jì)60年代起全世界范圍內(nèi)以作物矮化育種為標(biāo)記的“綠色革命”使作物的產(chǎn)量得到了大幅度的提高。

1.1 水稻矮稈性狀的遺傳研究

從廣義上講，水稻的矮生性是指成熟期水稻株高比正常植株縮短的遺傳特性。經(jīng)典遺傳學(xué)表明水稻株高既屬于數(shù)量性狀，又表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳。在秈稻中，矮稈遺傳主要受1個隱性半矮稈基因控制（sd1），遺傳力較高，與高稈品種雜交后代呈高稈和矮稈的雙峰分布，并且大多數(shù)半矮稈秈稻品種的半矮稈基因均為sd1的復(fù)等位基因。在粳稻中，矮稈遺傳與秈稻相似，但根據(jù)控制矮稈的基因?qū)?shù)可以將粳稻矮稈品種分為兩類，一類由單個矮稈主效基因控制，另一類由多個矮稈微效基因控制，而且控制粳稻矮稈的主效基因一般為非等位關(guān)系[1-2]。

20世紀(jì)末，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記對控制水稻株高性狀進(jìn)行QTL檢測，將對水稻矮稈性狀遺傳研究從經(jīng)典遺傳學(xué)的水平深入到分子水平，為最終闡明水稻矮稈的遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[3]。1986年日本的水稻基因符號、命名和連鎖群委員會將矮稈基因統(tǒng)一定名。具有強(qiáng)矮化效應(yīng)、植株表現(xiàn)為矮稈（狹義）類型的基因定名為d系統(tǒng)，而具有較弱矮化效應(yīng)、植株表現(xiàn)為半矮稈類型的基因定名為sd系統(tǒng)，根據(jù)被鑒定的時間順序，從1往后排[4]。目前，已分別注冊到d-62和sd-8，其中部分矮稈（半矮稈）基因是相同的或等位的；例如，d-6和d-34，d-10、d-15和16，d-11和d-8，d-12和d-50，d-14和d-10，sd-1和d47分別是等位的。

1.2 水稻植株矮化機(jī)制研究

水稻植株矮化是矮稈主基因表達(dá)作用的結(jié)果，同時也受到修飾基因或抑制基因的影響[5]。一般認(rèn)為矮稈基因的作用能直接導(dǎo)致水稻植株形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)的變化，如節(jié)間變短和細(xì)胞個數(shù)減少，從而使植株變矮；同時，基因的表達(dá)還受到外部環(huán)境和內(nèi)源條件的影響。

1.2.1 水稻植株矮化與節(jié)間或細(xì)胞長度、數(shù)目的關(guān)系20世紀(jì)80年代前，有關(guān)水稻矮稈機(jī)理的研究主要集中在外部形態(tài)。由于細(xì)胞的生長和功能決定植株器官的結(jié)構(gòu)和功能，分析水稻植株的矮化機(jī)理有必要進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的研究。Kamijima等[6]通過對許多等基因矮稈系的研究，發(fā)現(xiàn)節(jié)間長度與細(xì)胞數(shù)目呈高度正相關(guān)，而與細(xì)胞長度無顯著相關(guān)性，表明節(jié)間的縮短可能是細(xì)胞數(shù)目減少的結(jié)果。

1.2.2 水稻植株矮化與溫度的關(guān)系部分矮稈基因?qū)λ局仓甑陌捵饔门c溫度存在相互作用。此外，攜帶矮稈基因d58的植株在低溫條件下生長時表現(xiàn)矮稈小粒，在高溫條件下則表現(xiàn)正常[7]。

1.2.3 水稻植株矮化與植物激素的關(guān)系水稻的生長和發(fā)育主要受到六類植物激素的調(diào)節(jié)，它們分別是生長素（Auxin），赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin）、脫落酸（ABA），乙烯（Ethylene）和油菜素幽醇（BRs）。6種激素中，GA與植物株高性狀關(guān)系最密切[8]。目前已克隆的矮稈基因有Sd1和D18，分別編碼赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶GA20-氧化酶和GA3-氧化酶[9]。如d1突變體，目前d1基因已經(jīng)克隆，它編碼一個G蛋白α亞基，參與了GA的信號傳導(dǎo)[10]。

近年來的研究表明水稻矮化也與BR的合成及其信號傳導(dǎo)受阻有關(guān)。在擬南芥中已經(jīng)克隆到5個與BR合成相關(guān)的基因（Dim，Cpd，Dwarf1，Dwar4和Dwarf7）以及2個與BR傳導(dǎo)相關(guān)的基因Bri1和Bri2分別編碼一個富含亮氨酸的蛋白激酶以及一個GSK3/SHAGGY類似的激酶[11-12]。在水稻中也克隆到了2個與BR合成相關(guān)的基因OsBR6ox和D2以及1個與BR傳導(dǎo)相關(guān)的基因Osbri1[13-14]。

1.3 水稻矮化材料的利用研究

中國秈型矮源在全球秈稻矮化育種中起到了啟動和關(guān)鍵作用。除中國大陸外，低腳烏尖幾乎是所有矮化品種的共同祖先。粳稻的矮生性以日本最早開始研究，主要矮源有農(nóng)林8號、農(nóng)林1號、農(nóng)墾58、藤坂5號、石狩白毛和金南風(fēng)；意大利品種巴利拉（Balilla）也是粳稻育種的主要親本。在水稻中己鑒定了d1至d61共55個矮稈基因，但只有“d47”（即sd1）在水稻育種中發(fā)揮了作用。同一矮稈基因的廣泛利用潛藏著由遺傳單一帶來的風(fēng)險。因而發(fā)掘、鑒定和利用新矮源應(yīng)成為當(dāng)今水稻育種中的重要研究內(nèi)容[15]。

2 水稻基因精細(xì)定位與克隆

隨著擬南芥和水稻基因組的測序完成，一個重要的目標(biāo)就是鑒定和克隆在農(nóng)藝生產(chǎn)上有價值的基因。目前主要的策略是采用圖位克隆法以及利用突變體和生物信息學(xué)。

2.1 圖位克隆的原理

克隆基因最經(jīng)典的方法就是圖位克隆法。圖位克隆法主要包括4個基本技術(shù)環(huán)節(jié):目的基因的初步定位；精細(xì)定位；目的基因所在區(qū)域物理圖譜的構(gòu)建；篩選cDNA文庫或基因組文庫并進(jìn)行功能互補(bǔ)實驗。其中目的基因的精細(xì)定位是圖位克隆策略中最艱苦和最耗時的限速步驟。利用混合樣品作圖可以有效地提高精細(xì)定位的效率[16]。

2.2 圖位克隆的應(yīng)用

隨著水稻高精密遺傳圖譜和物理圖譜的相繼構(gòu)建成功[17]，尤其是全基因組測序結(jié)果的公布[18]，為水稻基因的精細(xì)定位以及后續(xù)的圖位克隆創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。早期在水稻中克隆的兩個抗白葉枯病基因和兩個抗稻瘟病基因均是利用圖位克隆戰(zhàn)略完成的[19-20]。最近報道的一些水稻基因的圖位克隆則是以突變體為材料，如矮稈基因d1、d2、單分蘗基因Moc1和脆稈基因BC1[21]。Ashikari等[10]從13000個F2植株中選取了3185個矮稈植株，應(yīng)用RFLP和STS等分子標(biāo)記將d1基因定位于0.15 cM的小區(qū)域內(nèi)，并應(yīng)用EST最終克隆d1基因。

以QTL為起點的圖位克隆則相對于主基因的克隆更為困難一些，主要是由于QTL的效應(yīng)一般都較小又受基因組背景的調(diào)節(jié)，且易受環(huán)境的影響。1996年Alpert和Tanksley首次在番茄中克隆了控制果重的QTL[22]。迄今，最為成功的例子莫過于日本研究人員對一系列水稻抽穗基因的克隆:Hd1、Hd3a和Hd6[23]。

2.3 生物信息學(xué)的應(yīng)用

隨著擬南芥和水稻基因組的測序完成以及數(shù)據(jù)的釋放，生物信息學(xué)越來越凸現(xiàn)出其重要性。當(dāng)目的基因精細(xì)定位到一定小的區(qū)域時，候選基因的確定就非常關(guān)鍵了。應(yīng)用生物信息學(xué)可以快速、省時和準(zhǔn)確地確定目的基因。Li等[24]將單分孽基因Moc1精細(xì)定位到約20 kb的小區(qū)間，通過基因注釋，發(fā)現(xiàn)在20 kb的小區(qū)間里有一個編碼蛋白與番茄的Lateral Supperssor（LS）蛋白高度同源。

對QTL的克隆同樣依賴于生物信息學(xué)。在QTL精細(xì)定位甚至是初步定位的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)提取眾多的預(yù)測基因，并通過對性狀及生理生化等的分析，從而可以確定候選基因，最終克隆基因。Ishimaru等[25]就利用日本晴及其一個近等基因系NIL-6，在QTL初步定位的基礎(chǔ)上分離和鑒定了一個控制株高的基因，位于第1染色體長臂上的一個淀粉合成相關(guān)基因:蔗糖磷酸合酶（SPS）。

2.4 突變體資源的應(yīng)用

2.4.1 T-DNA直接插入法T-DNA利用其轉(zhuǎn)移特性插入到植物基因組中。T-DNA插在基因組不同的部位造成各種插入結(jié)果。由于多數(shù)突變性狀是由隱性基因決定的，因此一旦確定了突變性狀和T-DNA是連鎖的，就可以通過獲得旁鄰序列，從而得到被標(biāo)簽的功能基因。

2.4.2 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)插入法由于轉(zhuǎn)座子的特殊特性（它的插入會引起基因突變，而當(dāng)它割離之后基因的功能又可以恢復(fù)），可以將它作為一個插入突變原，用來克隆因為轉(zhuǎn)座子插入而失活的基因。

2.4.3 逆座子標(biāo)簽法逆轉(zhuǎn)座子被認(rèn)為與基因的復(fù)制和基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)。當(dāng)植物染病、創(chuàng)傷或是在組織培養(yǎng)時都會發(fā)生逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座。

2.4.4 增強(qiáng)標(biāo)簽法因為正常情況下基因產(chǎn)物的數(shù)量是限定的，必須與其他產(chǎn)物達(dá)到平衡。基因產(chǎn)物的不足或過量都會破壞這種平衡，并表現(xiàn)出生長與發(fā)育的異常。該標(biāo)簽系統(tǒng)在T-DNA的右邊界附近加入多個串聯(lián)的啟動子，促使細(xì)胞中某一基因過量表達(dá)。

根據(jù)突變體的表型，利用生物信息學(xué)可以查找擬南芥以及其它禾本科作物中已經(jīng)克隆到的基因，通過序列的比對，在水稻中找到一些同源基因，繼而進(jìn)行基因的克隆與功能研究。最新報道的一些水稻基因就是通過這種策略完成的，如d18、Osbri1和OsBR6ox[26]。Mori等[14]獲得一個單隱性矮稈突變體后，通過表型的觀察、外源激素的處理以及內(nèi)源激素含量的測定，發(fā)現(xiàn)矮稈是由于BR合成的一個關(guān)鍵酶BR-6-氧化酶缺失引起的，通過數(shù)據(jù)庫的查找，發(fā)現(xiàn)了一個與番茄中編碼BR-6-氧化酶的Dwarf基因以及擬南芥BR6ox基因同源的EST，野生型和T2代突變體DNA序列的測定驗證了缺失和插入引起了移碼并造成了的OsBR6ox的功能缺失。

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