超臨界CO2萃取麥冬中高異黃酮類物質(zhì)的工藝研究

曾品濤，鄭一敏，胥秀英，傅善權(quán)，胡 楊，李 杰

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400050)

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.) Ker－Gawl.的塊根，其化學(xué)成分主要有甾體皂苷、高異黃酮、多糖、氨基酸、揮發(fā)油等[1]，其中高異黃酮具有多種生理活性。麥冬中 R－甲基沿階草酮A和B等高異黃酮類對HeLa－S細胞有較強的細胞毒性[半數(shù)抑制量(IC50)低于10μg/mL][2]。對豚鼠給予甲基麥冬黃烷酮A或B(30mg/kg)，對因辣椒引發(fā)咳嗽的抑制率為49.7%[3]。但目前關(guān)于麥冬黃酮類化合物提取工藝的文獻報道較少，且采用的溶劑提取法存在溶劑消耗量大、生產(chǎn)周期長等問題。采用超臨界萃取(supercritical fluid extraction，SFE)技術(shù)提取黃酮類化合物，具有工藝流程短、萃取效率高、萃取分離一步完成等優(yōu)點，但利用超臨界CO2萃取麥冬中高異黃酮類物質(zhì)尚未見報道。麥冬中的黃酮類物質(zhì)大多數(shù)為高異黃酮苷元，極性較小，適宜采用超臨界CO2萃取法。

1 儀器與試藥

TC－SPE－50－0.5－210S型0.5 L超臨界萃取裝置(沈陽天誠超臨界萃取有限公司)；TU－1901型雙光束紫外可見光分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；GFN－14型電動微型粉碎機(四川自貢市漸飛機械廠)；BuCHIRotavapor R－124型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BuCHI公司)；KQ－50型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)；SHZ－C型循環(huán)水式多用真空泵；AE200S型電子天平(梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司)。麥冬為四川綿陽栽培品種，經(jīng)本院傅善權(quán)副教授鑒定為川麥冬 Ophiopogon japonicus(L.)Ker－Gawl.的干燥塊根)；二氧化碳(重慶朝陽氣體廠，純度不低于99.5%，食品級)；6－甲酰基沿階草酮甲標準品(上海海燦生物技術(shù)有限公司)；95%醫(yī)用乙醇；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 麥冬總高異黃酮含量測定

2.1.1 溶液制備

精密稱取6－甲酰基沿階草酮甲標準品適量，加95%乙醇制成質(zhì)量濃度為1.32μg/mL的對照品溶液。稱取超臨界萃取干燥物約71.35mg，稱定精密，加95%乙醇定容至10 mL，超聲處理，過濾，作為供試品溶液，備用。

2.1.2 測定波長確定

精密吸取對照品溶液和供試品溶液適量，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液在290 nm波長附近均有最大吸收峰，故確定測定波長為290 nm。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL，分別置10mL量瓶中，用95%乙醇稀釋，定容，于290 nm波長處測定吸光度，以對照品質(zhì)量濃度 X(μg/mL)對吸光度 Y進行線性回歸，得回歸方程 Y=0.052 92X+0.067 76，r=0.999 4(n=6)。結(jié)果表明6－甲酰基沿階草酮甲質(zhì)量濃度在5.28～11.88μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密移取對照品溶液6份，各0.5mL，置10mL量瓶中，超聲定容，依法測定。結(jié)果吸光度平均值為0.415，RSD= 0.86%(n=6)。

重復(fù)性試驗：稱取同一批超臨界萃取物6份，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，再分別精密移取100μL，按線性關(guān)系考察項下方法操作。結(jié)果吸光度平均值為0.63，RSD=1.43%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗：分別精密移取同一供試品溶液100μL，按線性關(guān)系考察項下方法操作，每間隔20min測定1次。結(jié)果吸光度平均值為0.579，RSD=1.35%(n=6)。

加樣回收試驗：稱取已知含量麥冬粉末6份，每份加入適量對照品，進行超臨界CO2萃取，按2.1.1項下方法制備待測溶液，按線性關(guān)系考察項下方法操作，測定吸光度，代入回歸方程計算含量。結(jié)果平均回收率為98.75%，RSD=0.62%(n=6)。

2.2 正交試驗

以總高異黃酮含量為評價指標，將萃取溫度(因素A)、萃取壓力(因素B)、萃取時間(因素C)、夾帶劑量(因素D)作為考察因素[4]，采用L9(34)正交表進行試驗，平行3次，取平均值進行分析，因素水平表見表1。將麥冬于50℃干燥12 h，粉碎(40～60目)。準確稱取粉末100g，置萃取釜中，設(shè)定分離器Ⅰ壓力為6～7MPa，溫度為35℃，分離器Ⅱ壓力為4～6MPa，溫度為35℃。選用乙酸乙酯、95%乙醇混合溶劑(2∶1)作為夾帶劑，CO2流量控制在4.8 kg/h。將萃取液過濾、干燥，按2.1.1項下方法操作，測定吸光度，計算出萃取率。結(jié)果見表2。直觀分析顯示，總高異黃酮提取率的影響因素大小順序為B＞C＞A＞D，最佳試驗條件為 A2B2C3D3，即萃取溫度55℃，萃取壓力20MPa，夾帶劑2.0mL/g，萃取120min。

表1 因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 最佳工藝驗證試驗

按照正交試驗最佳工藝條件進行試驗，裝料100g和125g，分別重復(fù)3次。結(jié)果總高異黃酮的平均萃取率為1.67‰，RSD為1.69%(n=3)。

3 討論

萃取率隨萃取溫度的升高而增大，55℃時達到最大。其原因可能是麥冬中的多糖含量較高，達到95%～98%[5]。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，溫度對麥冬粉末的黏度影響較大，黏度在一定范圍內(nèi)能夠增強溶質(zhì)與溶劑的傳遞效應(yīng)，但黏度過大時則會起到相反作用。

麥冬中的高異黃酮類物質(zhì)極性較小，易溶于乙酸乙酯，能溶于正己烷。單獨采用95%乙醇作夾帶劑，體積達到3.0mL/g時仍不能達到最佳萃取率；單獨采用乙酸乙酯作夾帶劑時，接樣時萃取液極易氣化，損失嚴重。預(yù)試驗結(jié)果顯示，95%乙醇與乙酸乙酯比例為2∶1時，萃取率最大。

本試驗中，采用超臨界CO2萃取工藝，麥冬中總高異黃酮的含量可達0.167%，明顯高于溶劑提取法的含量[6－7]。目前麥冬黃酮的含量測定均采用橙皮苷或蘆丁為對照品，與麥冬中的主要黃酮類物質(zhì)高異黃酮在結(jié)構(gòu)上存在一定差異，紫外吸收光譜差異較大。本試驗中采用6－甲酰基沿階草酮甲為對照品，能更加精確地測定麥冬中高異黃酮的含量。

[1]林 曉，周強峰，徐德生.麥冬藥理作用研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2004，38(6)：59－61.

[2]怡 悅.麥門冬的細胞毒性成份[J].國外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊，1999，21(5)：42－43.

[3]Kamei A，Ichiki H.Antitussive agents and pharmaceutical compositions containing methylophiopogonanone[P].CODEN：JKXXAFJP 2003327529 A2，2003－11－13.

[4]時海燕，徐春波.淺析影響中藥超臨界CO2萃取的因素[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23(2)：120－122.

[5]肖培根.新編中藥志(第1卷)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：482.

[6]楊清林，顧月翠，姜榮蘭.川麥冬及其炮制品總黃酮和微量元素的比較[J].華西藥學(xué)雜志，1995，10(2)：77－78.

[7]宋金春，曾本富，蔡鴻生.麥冬不同炮制品中總黃酮含量分析[J].中藥材，1989，12(12)：34.