酶解海洋生物源蛋白制備活性肽研究進展

胡文婷,張 凱

(1.海南大學 海洋學院,海南省熱帶水生生物技術重點實驗室,海南 海口 570228; 2.海南海靈化學制藥有限公司,海南 海口 570102)

海洋是地球上最大的生物儲庫。遼闊的海洋生長著十幾萬種海洋動植物,從海洋獲取的魚、蝦、貝、藻等,為人類提供了豐富的海洋蛋白資源,是人類的蛋白類食物及生物活性物質的重要來源。現在人們直接和間接食用的動物蛋白質,約有四分之一來自海洋。海洋生物源蛋白無論在種類還是數量上都遠遠大于陸地生物源蛋白。并且海洋生物的蛋白質結構與功能和陸地生物相比也有較大的差別,其中蘊藏著許多功能特異、結構新穎的多肽類物質。選擇合適的蛋白酶對海洋生物源蛋白的多肽鏈進行水解切割,把具有生物活性的肽片斷釋放出來,就可以制備出功能多樣、結構新穎的海洋生物活性肽。

1 制備工藝研究

1.1 蛋白酶的選擇

對于同一蛋白底物,由于不同蛋白酶的酶切位點不同,所得到的肽片斷分子質量大小和氨基酸組成也各有差異,因此水解產物的理化功能特性也會有較明顯的差別。比如胰蛋白酶酶解位點較少,所以酶切產物片斷較大。木瓜蛋白酶的酶切位點廣泛,釋放出來的肽的分子質量比較小。蛋白水解物的營養價值和風味的好壞,也很大程度上依賴于所用酶的不同。水產品在水解加工過程中往往會產生較重的苦腥味,苦腥味的存在已成為酶解物在食品及醫療保健品中應用的主要限制因素,因此制備中應盡量減少苦味,提高其風味氨基酸和呈味肽的含量。Kristinsson等[1]比較了4種堿性蛋白酶對大西洋鮭魚的水解效果及其水解物的生物化學性質和功能特性,以Alcalase 2.4L水解物的各項性能指標最佳。劉春娥等[2]對魷魚(Loligo)的內臟蛋白質進行酶解,發現中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶具有較好的水解效果,胃蛋白酶水解效果較差,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在一定條件下具有顯著的協同水解效應。曾慶祝等[3]探討了胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合風味酶、枯草桿菌(Bacillus subtilis)蛋白酶酶解扇貝(Placopecta magellanicus)邊所得酶解物對羥自由基(·OH) 的清除效果及酶解物的體內抗氧化作用,篩選出枯草桿菌蛋白酶為最佳水解酶。另外,在對蝦殼和蝦頭[4]、羅非魚(Oreochromisspp.)肉[5]等海洋來源蛋白的酶解中,篩選出的最佳水解酶也各不相同。目前雖然對各種蛋白酶的篩選研究較多,但是因底物蛋白和評價標準的不同,仍無哪種酶可作為普遍適用的最佳水解酶。

海洋獨特環境成了新型蛋白酶開發的新源地,成為篩選蛋白酶的新焦點,海洋蛋白酶往往具有區別于陸地蛋白酶的新特性,如低溫堿性、高溫堿性等性質,一些研究者將其應用于海洋生物源蛋白的酶解,結果均顯示出了獨特的效果。美國的Kristinsson等[6]把從鮭魚(Oncorhynchus tschawytscha)內臟中所制備的絲氨酸型蛋白酶與商品化蛋白酶(Alcalase 2.4L,Flavourzyme 1000L,Corolase PN-L以及Corolase 7089)對海洋魚蛋白進行水解研究,結果表明在相同的水解條件下,從鮭魚內臟中制備的絲氨酸型蛋白酶的水解效果最好。中國水產科學研究院黃海水產研究所酶工程實驗室將從海洋微生物分離到的蛋白酶應用于櫛孔扇貝(Chlamys farreri)裙邊和鱈魚(Gadoux macrocephalus)碎肉的酶解,發現其中海洋蛋白酶YS-894和YS-80均表現出優于一般陸地蛋白酶的水解效果,推測海洋來源的蛋白酶可以選擇性的作用于親水性氨基酸殘基,對海洋生物源蛋白的水解特異性較強[7]。山東大學微生物技術國家重點實驗室從1 800 m的深海淤泥中分離得到產低溫蛋白酶的耐冷菌,并用于酶解鯊魚、牡蠣、扇貝和毛蝦,也取得了良好的效果[8]。

1.2 酶解條件優化

酶解時間是影響最終效果的重要因素,隨著反應時間的延長,多肽得率呈現了三個階段的趨勢：第一階段的水解過程中,多肽得率的上升速度很快,隨后進入第二階段的緩慢增長,第三個階段為平衡期,此時體系中的多肽含量最高。隨著反應的進一步進行,水解度進一步增加,但是多肽得率出現了輕微的下降趨勢,這是因為在平衡狀態的后期,蛋白酶將體系中的肽進一步水解而產生了更多的氨基酸,由于多肽的活性位點遭到破壞,同時也伴隨著活性的下降。這種蛋白酶解典型的曲線在許多酶解海洋生物源蛋白的研究中被證實。

在不同的反應體系中,酶解的最適溫度和pH受到底物種類、濃度、緩沖液等因素的影響。雖然對水解效果的最終評判標準不同,但是多數蛋白酶在水解目的蛋白時的最適溫度和最適 pH與其水解能力最強時的溫度和 pH相差不大,并且隨著溫度和pH的增加,總體效果呈現先增大后減小的趨勢。

酶與底物反應速度在一定程度上取決于固液比和加酶量。Guerard等[9]以堿性蛋白酶為催化手段,研究了黃鰭金槍魚(Thunnus albacares)的加工下腳料的蛋白水解影響因素,提出可供水解鍵的濃度是決定水解速度的關鍵因素。在酶被底物飽和之前,用量大一些對于水解反應本身沒有不良效果,但會引起使用成本的增加。當固液比較低時,酶與底物結合幾率較少,反應速度較慢,適當增加底物濃度有利于反應向生成物方向進行,因而反應速度加快。但當所有的酶都結合了底物被飽和之后,即使固液比再增加,反應速度也已達到了飽和狀態,反應速度不再增加。同樣,當酶的用量較小時,水解度隨著酶的加入量增大而明顯增加,當酶的濃度增加到一定程度時,底物濃度已不足以使酶飽和,反應速度變小,再增加酶的濃度水解度的變化幅度已經很小了。

在單因素試驗的基礎上,繼續考察多因素之間的相互影響,選用較多的試驗方法為正交試驗或均勻設計。也有學者利用其他的數學模型進行探討,如趙梅等[10]利用響應面法對羅非魚下腳料進行了酶解工藝的優化,結果表明利用該方法控制工藝操作參數可以優化產物的特性。在對陸地來源的蛋白,如米渣、鳙魚(Aristichthys nobilis)等進行酶解時,有研究者利用神經網絡實現對酶解過程的模擬仿真[11,12],提高優化結果的精度,但是在酶解海洋生物源蛋白制備活性肽方面還未見有相關報道。

1.3 分離和分析技術

酶對蛋白質的水解作用使產物具有分子質量降低、離子性增加及疏水性基團暴露等特性,在酶解制備多肽的過程中,酶的種類、濃度,水解的時間、pH和溫度等因素均會影響水解率和最終水解液的組成。蛋白酶解物的成分非常復雜。對蛋白酶解物中的生物活性肽分離純化技術的研究目前主要集中在各種低壓柱層析、高壓液相色譜、超濾(膜分離方法)、毛細管電泳等幾個方面。實際操作中采用何種分離方法,則由所提取分離的物質性質決定。

利用不同截流分子質量的超濾膜對酶解液進行分段,可以同時起到濃縮和分離純化的作用。由于其可在維持原生物體系環境的條件下實現分離,并且操作簡單,能耗低,因此受到很多研究者的重視。Joen等[13]用超濾技術對鱈魚蛋白水解物進行分段,在獲得的三部分肽片段中,分子質量介于 3～10 ku的肽片段抗氧化性能最好,而小于 3 ku的肽片段,具有明顯的 ACEI功能。汪濤等[14]以聚砜中空纖維為膜材料的超濾裝置對扇貝邊酶解液進行分離,經超濾的酶解透過液在色澤、風味、澄清度等方面均理想,營養成分保持較好,氨基酸態氮保存率較高。Vandanjon[15]用膜蛋白對藍鱈魚肽進行濃縮和純化,高截留分子質量的膜用于分離多肽和未水解的蛋白,中截留分子質量的超濾膜可以對一定分子質量范圍的多肽進行濃縮,最后用納濾濃縮小分子質量的肽類,并且同時除鹽。

在對多肽的進一步分離和分析中,如果要得到單一成分,一般采用幾種色譜相結合或毛細管電泳的方法,然后對分離得到的組分進行氨基酸分析、序列分析或質譜進行結構確證。Wang等[16]用Sephadex LH-20凝膠層析和 RP-HPLC從牡蠣(Crassostrea talienwhanensis crosse)蛋白水解液中純化出了一個由9個氨基酸殘基組成的具有AECI活性的小肽,氨基酸序列為 VVYPWTQRF。Wu等[17]通過超濾、凝膠層析、RP-HPLC從鯊魚肉的酶解液中分離出4個肽組分,并且通過二次離子質譜確定其序列分別為Cys-Phe,Glu-Tyr,Met-Phe,Cys-Glu。Zhao[18]采用離子交換層析、凝膠層析和反相高效液相色譜的方法從海地瓜(Acaudina molpadioidea)中分離得到1個分子質量為 840 u的小肽,由 5種主要的氨基酸組成(Glu,Asp,Pro,Gly,Ala)。Je 等[19]從金槍魚(Thunnus thynnus)骨的水解液中,利用連續的色譜分離得到一個抗氧化肽,并且通過 ESI-MS確定其序列為VKAGFAWTANQQLS(1 519 u)。He[20]通過對魚、蝦、貝和藻類等的水解液進行研究認為,使用毛細管電泳(CE)可以得到與 HPLC同樣精確的結果,并且毛細管電泳的方法更快速,也更經濟。

但是要從蛋白酶解物這一相對比較復雜的體系中分離純化出具有一定生理功能的生物活性肽物質,并且要實現大規模的工業化制備水平的分離純化,并不是每一種方法都是可靠的、可行的。也有研究者認為,從應用的角度來考慮,由于酶解液的生物活性往往是多種肽混合物共同作用的結果,如采用色譜等技術對其進行純化可能造成活性的部分損失且成本較高,不適合工業化生產,最佳的解決方法還是應通過對酶解過程的控制來實現[16]。

2 海洋生物源蛋白酶解物的主要活性及應用領域

目前酶解海洋生物源蛋白所得到的生物活性肽主要有ACE抑制肽、抗氧化肽、抗菌肽、提高人體免疫、抗腫瘤的肽類和膠原肽等。

2.1 降血壓肽

降血壓肽是一類血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI),通過抑制ACE活性而達到降血壓的作用。1986年,Suesuna等[21]最先從沙丁魚和帶魚的水解物中發現了血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽。在接下來的研究中,從多種食源性海洋生物源蛋白中均分離出了降壓肽類物質,Seki等[22]用蛋白酶酶解沙丁魚、帶魚、牡蠣、蝦、蟹等 12種食物蛋白,Matsui[23],Astawan等[24]用蛋白酶水解沙丁魚和魚干,Byun等[25]對阿拉斯加青鱈魚(Theragra chalcogramma)魚皮進行水解,Fujital用嗜熱菌蛋白酶消化鰹魚(Katsuwonus pelamis)均得了較高活性的ACEI。時瀚等[26]以黃海的22種魚類為研究對象,對酶解得到的ACEI-22進行聚乙二醇修飾后其對自發性高血壓大鼠的降壓效果與卡托普利的效果相當。很多研究均表明從魚肉、蝦、蟹等水產動物蛋白中制得的酶解降血壓肽其降壓活性要優于其他食物性蛋白來源,日本已有用沙丁魚(Sardina melamosticta)制取的酶解降血壓肽問世[27]。

血管緊張素轉化酶抑制劑是目前用于治療高血壓的重要一線藥物,食物蛋白源ACE抑制劑因其高安全性,副作用小、易吸收,成為活性肽研究領域的熱點,已經通過實驗證實酶解蛋白來源的降血壓肽無任何毒副作用,并且只對高血壓患者起到降壓作用,對血壓正常者則無降壓作用,這些特點都是普通的化學合成降壓藥所不具備的,因此ACE抑制肽在開發為藥物和具有降血壓功能的功能食品中具有廣闊的應用前景。

2.2 抗氧化肽

自由基可造成機體的多種損傷和病變,加速機體的衰老。抗氧化肽作為自由基清除劑可清除體內多余的自由基,從而增強機體免疫力,延緩衰老。據報道Qian等[28]從牡蠣(Carnis ostreae)蛋白、Je等[29]從阿拉斯加鱈魚(Theragra chalcogramma)骨架、Kim等[30]從皮氏叫姑魚(Johnius belengerii)骨架蛋白、Mendis等[31]從秘魯魷魚(Dosidicus gigas)皮膚膠原蛋白、Wu等[32]從花腹鯖(Scomber austriasicus)的酶解產物中均分離得到了具有抗氧化活性的功能肽。這些抗氧化肽的抗氧化能力與α-生育酚、抗壞血酸等相比,在清除羥自由基、超氧陰離子、DPPH自由基,抑制脂質自氧化方面,均優于這些現在廣泛使用的天然抗氧化劑。

此外有報道證實有些抗氧化肽還具有抗癌、抗誘導及抗衰老等其他生物活性。水解扇貝內臟團得到的抗氧化活性肽PCF具有明顯的抗皮膚衰老及抗紫外線對皮膚損傷作用,并且對小鼠的肝臟和胸腺淋巴細胞的活性具有促進或保護作用[33]。水解牡蠣得到的抗氧化肽對自由基引起的DNA損傷具有保護作用,對人肺成纖維細胞和巨噬細胞均無細胞毒性[29]。

酶解蛋白制備的生物活性肽具有生理活性強、安全可靠等優點,已成為新型天然抗氧化劑的主要來源。另外,海洋生物源蛋白酶解后普遍呈現出溶解性好,乳化性強,流動性增加等優點。因此,酶解海洋生物源蛋白制備的抗氧化肽作為天然抗氧化劑不僅在食品工業,而且在醫藥、化妝品和整形外科等領域中都將得到廣泛應用。

2.3 抗菌肽

抗菌肽是一類具有作用迅速、抗菌力強、抗菌譜廣、活性穩定、不易產生耐藥性等特點的小分子短肽。最初人們對于抗菌肽的研究都集中在由細菌、植物和動物產生的內源肽,并且在海洋生物中也發現了大量的內源性抗菌肽存在,自1988年日本學者Nakamura等[34]首次從海洋生物-鱟中發現抗菌肽以來,目前已從蟹、對蝦、貽貝、魚等多種海洋生物中分離到數種抗菌肽或類似抗菌肽物質。近來的研究發現食物蛋白經酶解也有可能產生出有效的抗菌肽,如對酪蛋白、乳鐵蛋白等大分子蛋白進行水解,均分離得到了抗菌肽類物質。對海洋生物源蛋白酶解制備抗菌肽的工作起步較晚,但是也已經逐步引起了關注。Liu等[35]用堿性蛋白酶Alcalase和菠蘿蛋白酶對牡蠣進行水解,從水解液中分離得到了富含半胱氨酸的抗菌肽CgPep33,該肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都具有抑制作用,并且對草莓灰霉病具有顯著的抑制作用。貽貝(Mytilus edulis)酶解物中的小肽對果蔬病原菌Botryis cinerea有良好的體外抗菌活性,可考慮將其替代化學殺菌劑用于果蔬的保鮮[36]。

抗菌肽作為天然來源的生物活性物質,具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性,且不易產生抗藥性,目前的研究表明抗菌肽對人體無毒副作用,這些特色和廣闊的用途已經激起了人們極大的興趣,在耐抗生素病原菌株不斷出現的今天,抗菌肽有望成為新型的抗菌藥物。

3 展望

目前,酶解海洋生物源蛋白制備生物活性肽的開發與應用中還存在著一些問題,如：

(1)酶解的過程的精確控制。要想最終得到符合我們要求的活性肽,必須對其水解的過程進行嚴格的控制,蛋白酶的選擇和水解度的大小等因素不但影響酶解物的組成,而且與水解物苦腥味的大小也有關系。這些因素之間往往又互相影響互相作用,很難建立一個適應面很廣的理論模型來反映酶解的全過程,對現有模型的效果也仍需進一步的討論和完善。

(2)多肽活性的深入研究。對水解的肽類活性雖然已經有了廣泛的研究,但是這些研究大多數還僅僅停留在依靠簡單化學方法的體外活性研究,而在體內活性和應用效果方面的研究較少。要想進一步發掘海洋生物源蛋白酶解產生的肽類物質的應用價值,必須對其現有活性進行深入探討,如許多抗氧化活性的肽類具有抗腫瘤、增強免疫的活性,許多抗菌肽不但可以抑制細菌,也可以抑制真菌及一些農業病害菌。

(3)肽類物質的化學結構修飾。在對酶解得到的多肽進行分離純化后,從很多酶解物中都得到了一系列具有活性的單一物質,這些物質有些在體外表現出良好的活性,可以作為潛在的藥物或先導化合物進行開發利用。但是在開發過程中卻往往受到多肽本身物理及生物化學性質的限制,如難以通過細胞膜、易被蛋白酶降解等因素導致了肽類藥物體內半衰期短、口服生物利用度低等缺點,不利于將其用于臨床治療[37]。對肽類進行化學結構上的修飾,如聚乙二醇化、糖基化等,是用以提高肽類藥物穩定性的主要策略,目前對海洋生物源蛋白酶解物的修飾研究還比較少,主要還是受到上游酶解工藝和分離技術等條件的制約。

盡管如此,蛋白水解的肽類在食品、保健品、醫藥、飼料、日用化工等領域的需求一直逐年迅速增長,目前市場現有量遠達不到需求量。我國作為一個海洋漁業和養殖大國,利用先進的酶技術開發海洋生物源蛋白活性肽,將為海洋水產品深加工提供廣闊的前景。

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