60 Co-γ射線輻射對家蠶抗菌肽誘導(dǎo)效應(yīng)研究

代君君 范 濤 周業(yè)奉 魏國清 范后文 肖林珍 吳傳華 王儲炎 田善富

(1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,安徽合肥 230061;2合肥永豐畜禽有限公司,安徽合肥 231200;3安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230036)

近年來,隨著青霉素等傳統(tǒng)抗生素長期、廣泛地使用,許多細菌都產(chǎn)生了明顯的抗藥性,已對人們的健康產(chǎn)生了嚴重的威脅,尋找安全可靠的抗生素的替代品已成為一個熱點問題。抗菌肽(antibacterial peptides)是生物體免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外源病原體的防御性多肽類活性物質(zhì),是生物體先天免疫的重要組成成分,在機體的先天非特異性免疫中起著非常重要的作用[1]。大量研究證明,與普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌譜”更廣,抗菌肽不但能殺死抗藥病原菌,在使用過程中也不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性突變,而且它能抑制細菌產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生對人體有害的細胞因子[2],因而極有希望開發(fā)成為一種新型的廣譜高效抗菌藥物。

根據(jù)氨基酸的組成和結(jié)構(gòu)特征,抗菌肽可分為天蠶素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainins)和蜂毒素(melittins)[3]等類型。由于抗菌肽具有無毒副作用、無殘留、無細菌耐藥性、熱穩(wěn)定、水溶性好、廣譜殺菌等優(yōu)點,且對畜禽具有促生長、保健和治療疾病的功能[4];因此,在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。

家蠶抗菌肽是其血淋巴中產(chǎn)生的具有抗菌活性的小分子多肽,在家蠶的天然免疫中起著至關(guān)重要的作用。由于在生物體內(nèi)天然抗菌肽含量很少,化學(xué)合成抗菌肽的成本太高,且抗菌肽的分子量較小,難以分離純化,價格昂貴,嚴重制約了抗菌肽在生產(chǎn)上的應(yīng)用;故探索如何獲得大量天然的抗菌肽,具有非常重要的意義。本研究采用不同劑量的60Co-γ射線對幾個家蠶品種進行輻射處理,測定其抗菌肽的抑菌效果,研究結(jié)果對開發(fā)抗菌肽提供了一定的理論依據(jù),也為家蠶的綜合利用探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試家蠶品種：871×872、872×871、菁松×皓月、皓月×菁松,由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供;供試菌種：枯草桿菌,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供;主要試劑：瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、LB液體培養(yǎng)基等,購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：L YO-2真空冷凍干燥機;G L-2L M型高速冷凍離心機;HP x-96MB E數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱;MLS-375三洋高壓滅菌鍋;PHS-4CT型精密酸度計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗菌肽的誘導(dǎo)與提取 參照文獻[5]的方法,將5齡第2天的871×872、872×871、皓月×菁松、菁松×皓月的家蠶,分別用60Co-γ射線輻射,輻射劑量為20 Gy(輻射8 min)、50 Gy(輻射20 min)、100 Gy(輻射40 min),以不作輻射處理的為對照區(qū);每個品種、每個處理20頭蠶,4個重復(fù),共計48個小區(qū)。輻射處理后的蠶正常飼養(yǎng)24 h之后,放到-30 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?0Co-γ射線輻射在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所完成。

采用乙酸浸提法[6]提取不同蠶品種的抗菌肽,取用經(jīng)過輻射處理后的不同處理的5 齡家蠶,分別稱量、剪碎并用組織搗碎機搗碎、勻漿,然后用等體積的5%乙酸混合,在4 ℃條件下攪拌過夜后隔水煮沸15 min,迅速冷卻。混合物在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心30 min后,取上清液放入冰箱在4 ℃條件下保存;沉淀物用等體積的5%乙酸混合,再次在4 ℃條件下攪拌、浸提過夜,重復(fù)上述離心過程,取上清液,合并2次上清液,將pH值調(diào)整為7.0,再次離心,棄沉淀,將上清液用液氮快速冷凍后,在真空壓力15 Pa、-65 ℃條件下進行冷凍干燥,收集凍干粉即為家蠶抗菌肽類物質(zhì)的粗制品。

1.2.2 家蠶抗菌肽類物質(zhì)抑菌活性的測定 按普通培養(yǎng)基的配制方法配制培養(yǎng)基[7],放入高壓滅菌鍋中高壓滅菌后備用。將枯草桿菌在普通固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,取生長良好的菌落放在液體培養(yǎng)基內(nèi),在37 ℃搖床上培養(yǎng)24 h,備用。另取5 mL經(jīng)過滅菌的普通固體培養(yǎng)基于9 cm培養(yǎng)皿中,冷卻到45 ℃左右溫度后,加上述枯草桿菌的菌液1 mL,迅速搖勻,待冷卻凝固后再進行下一步操作。

抑菌活性的測定參照葛兆宏[8]的紙片擴散法進行,取直徑為1 cm滅菌后的圓形濾紙片,每片濾紙均勻地涂上不同品種、不同處理的家蠶抗菌肽類物質(zhì)的上清液70 μL,然后均勻地排列在裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。移至培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察抑菌圈,測定抑菌圈的大小,用抑菌圈的直徑來反應(yīng)抗菌肽活性的高低。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別記錄4 個家蠶品種、3 種不同60Co-γ射線輻射處理對枯草桿菌抑菌圈的直徑,并對數(shù)據(jù)進行方差分析,說明不同處理、不同品種家蠶產(chǎn)生的抗菌肽,對枯草桿菌的抑菌效果和對家蠶抗菌肽抑菌能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻射劑量不同家蠶品種的抗菌肽對枯草桿菌的抑制作用

4個不同家蠶品種的5齡蠶經(jīng)過不同輻射處理產(chǎn)生的抗菌肽,對枯草桿菌都有明顯的抑制作用。從抑菌圈直徑大小來看,不同家蠶品種的5齡蠶經(jīng)過不同劑量60Co-γ射線輻射處理后產(chǎn)生的抗菌肽,對枯草桿菌的抑菌效果都有不同程度的增加,采用20 Gy的60Co-γ射線輻射處理的抗菌肽,對枯草桿菌的抑菌效果最好(圖1),其次是采用50 Gy和100 Gy的60Co-γ射線輻射后產(chǎn)生的抗菌肽對枯草桿菌的枊菌效果。從采用20 Gy的60Co-γ射線輻射不同家蠶品種產(chǎn)生的抗菌肽對枯草的抑菌效果來看,872×871抗菌肽的抑菌效果最好,對枯草桿菌的抑菌圈直徑為3.00 cm,比對照的2.10 cm提高了42.9%;871×872抗菌肽的抑菌效果其次,對枯草桿菌的抑菌圈直徑為2.57 cm,比對照的1.97 cm提高了30.5%;皓月×菁松與菁松×皓月抗菌肽的抑菌圈直徑相同,均為 2.20 cm,分別比對照提高了22.2%、27.2%(表1)。

表1 不同輻射劑量不同家蠶品種的抗菌肽對枯草桿菌的抑菌圈直徑

采用不同劑量的60Co-γ射線對家蠶進行輻射處理后,家蠶抗菌肽的抑菌圈直徑比對照組的抑菌圈直徑顯著增大,這表明60Co-γ射線輻射家蠶后其抗菌肽的抑菌活性增強,但不同品種之間的抑菌圈大小有所不同,不同輻射劑量處理對家蠶抗菌肽的抑菌活性也各不相同;但其抑菌活性表現(xiàn)出相同的規(guī)律,即在不同品種之間的抑菌活性為872×871＞871×872＞菁松×皓月＞皓月×菁松;在不同劑量之間是低劑量60Co-γ射線輻射的抗菌肽抑菌效果最高,隨著輻射劑量的增加,抗菌肽的抑菌效果有減弱的傾向。

圖1 20 Gy輻射劑量處理不同家蠶品種產(chǎn)生的抗菌肽對枯草桿菌的抑菌效果

2.2 不同品種、不同處理對家蠶抗菌肽的抑菌效果

為進一步說明品種、輻射處理對家蠶抗菌肽抑菌效果的影響,我們對表1 不同輻射劑量不同蠶品種的抗菌肽對枯草桿菌的抑菌圈直徑進行方差分析和F測驗(表2),從表2可以看出,不同品種F值20.12＞F0.01(3,9)=6.99,所以P＜0.01,這說明品種間的抑菌差異達到極顯著水平;不同輻照處理F值21.33＞F0.01(3,9)=6.99,所以P＜0.01,這說明不同輻照處理間的抑菌差異也達到了極顯著水平。

表2 不同輻射劑量不同蠶品種的抑菌圈直徑的方差分析

3 討論

近年來,藥物的濫用、殘留和細菌耐藥性等問題已經(jīng)嚴重地威脅著人們的健康;因此,尋找安全高效全新類型的抗菌藥物是解決上述問題的一條有效途徑。抗菌肽因抗菌活性高、抗菌譜廣、種類多、可供選擇的范圍廣,靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因,而被認為有廣闊的應(yīng)用前景。雖然可從機體內(nèi)提取抗菌肽,但含量極微,給其應(yīng)用帶來了極大的困難。為了能降低抗菌肽的生產(chǎn)成本,人們試圖通過基因工程手段來大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽,現(xiàn)已人工設(shè)計合成了抗菌肽D、BD及AD基因,并且成功地將其導(dǎo)入釀酒酵母及畢赤酵母中進行表達[9-12]但工藝復(fù)雜,表達成本高,表達量有限,這也制約著抗菌肽的進一步開發(fā)與應(yīng)用。本研究結(jié)果表明60Co-γ射線輻射可以有效增強家蠶抗菌肽的抑菌活性,這為開發(fā)和利用家蠶抗菌肽提供了基礎(chǔ)。

為探索抗菌肽在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,人們發(fā)現(xiàn)通過添食抗菌肽可以提高畜禽的抗病能力和促進畜禽的生長發(fā)育[13-14],但是由于抗菌肽分子量小、分離提取困難、價格昂貴等原因,嚴重制約著抗菌肽在生產(chǎn)上的應(yīng)用。王海富等[15]嘗試用人工飼養(yǎng)的蠅蛆養(yǎng)雞,蛋黃大,膽固醇含量低且雞極少生病,經(jīng)濟效益好;這為開展利用昆蟲的天然抗菌肽提供了有效途徑。家蠶是世界上飼養(yǎng)量最大的昆蟲,其飼養(yǎng)技術(shù)成熟,可以大規(guī)模生產(chǎn),家蠶抗菌肽研究也比較深入。因此,家蠶是新一代理想的高效抗菌劑載體。如果將家蠶直接作為飼料添加劑,既增加了飼料的營養(yǎng)成分,又省去了提取抗菌肽的中間環(huán)節(jié),必將降低生產(chǎn)成本,為開展家蠶的綜合利用提供了一條新的途徑。

本研究表明,利用適量的60Co-γ射線輻射家蠶可以有效提高家蠶抗菌肽的抑菌活性,在本研究中只采用了生產(chǎn)上的2 對品種和60Co-γ射線進行輻射處理,僅測定其抑菌活性,沒有對抗菌肽的類型進行鑒定;所以,不同品種、不同誘導(dǎo)源、不同誘導(dǎo)劑量所誘導(dǎo)的抗菌物質(zhì)的種類和數(shù)量是否有差異,還值得進一步深入研究。

[1]Boman H G.Antibacterial peptides：Key components needed in im-munity[J].Cell,1991,65：205-207.

[2]趙超.抗菌肽的研究現(xiàn)狀[J].科學(xué)之友,2008,27(1)：47-50.

[3]盧曉風(fēng),楊星勇,程驚秋.昆蟲抗菌肽及其研究進展[J].藥學(xué)學(xué)報,1999,34(2)：156-160.

[4]羅剛,魏泓.哺乳動物抗菌肽研究進展[J].四川動物,2002,21(4)：255-257.

[5]徐進署,張雙全.昆蟲抗菌肽對病原微生物作用的研究進展[J].昆蟲學(xué)報,2002,45(5)：673-678.

[6]朱祥瑞,陳玉銀,潘佩飛,等.蠶卵抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)及其蟻蠶的動物試驗[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,25(2)：183-186.

[7]范志勇,周定剛,吳明夏,等.豬小腸抗菌肽的抑菌作用研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2006,27(6)：99-101.

[8]葛兆宏.動物微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2001：165-167.

[9]王新,陳海旭.重組刺桐胰蛋白酶抑制劑a在大腸桿菌中的表達和純化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2002,18(3)：22-27.

[10]黃亞東,鄭青,李校堃,等.天蠶抗菌肽AD基因在AcNPV載體系統(tǒng)中的表達研究[J].中國抗生素雜志,2003,(5)：11-13.

[11]韓萬江,夏天輝.ApiIa抗菌肽基因的化學(xué)合成,克隆及其在酵母中的表達[J].復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版),1998,(2)：13-15.

[12]沈俊卿,田昱.抗菌肽ABP3基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表達[J].生物工程學(xué)報,1999,(4)：20-23.

[13]黃永彤,黃自然,黃建清,等.抗菌肽與抗生素飼喂肉雞的效果比較[J].廣東飼料,2004,13(2)：24-26.

[14]何丹林,溫劉發(fā),鄧春柳,等.蠶抗菌肽AD-酵母制劑對粵黃雞腸道消化酶和飼料品質(zhì)的影響[J].中國家禽,2004,26(7)：9-11.

[15]王海富.蠅蛆養(yǎng)雞養(yǎng)豬創(chuàng)特色[J].山西農(nóng)業(yè)(畜牧獸醫(yī)版),2007,(12)：40-41.