缺氧誘導因子-1α和CD105與胃癌的關系研究

于東穎 曲雪紅 王向巖

多數腫瘤的生長具有缺氧的微環境，腫瘤形成的關鍵步驟就是對缺氧的適應, 缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α)是細胞適應缺氧而產生的一種核轉錄因子，在多種惡性腫瘤如腸癌、乳腺癌、肺癌等組織中，HIF-1α均有過度表達并參與腫瘤血管形成。CD105是一種新型的血管內皮標記物,參與血管生成,在標記腫瘤相關的新生血管內皮上具有更高的特異性[1]。本實驗對70例胃癌、14例癌旁組織、15例正常組織中的HIF-1α、凋亡抑制基因及CD105標記的癌組織的微血管密度(MVD)進行了檢測，旨在探討胃癌發生發展過程中因缺氧而造成的HIF-1α的表達以及其對腫瘤血管形成的影響，為臨床治療新靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 我院2003～2005年外科手術切除胃腺癌石蠟包埋標本70例(男性39例,女性31例),年齡26～74(平均55.6歲)。其中高分化21例，中分化30例，低分化19例。浸潤程度:黏膜層18例，肌層33例,達漿膜層19例；淋巴結轉移31例，未轉移的39例。另取該組胃腺癌病例中腫瘤手術切除標本切緣處正常胃黏膜(病理證實)石蠟包埋標本15例及癌旁黏膜14例作為對照。濃縮型兔抗人HIF-1α多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,工作濃度為1∶150；即用型CD105鼠抗人單克隆抗體及SP試劑盒均購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 染色方法 已知陽性切片做陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照。福爾馬林固定胃腺癌標本，石蠟切片58℃烤4h，常規脫蠟至水，抗原修復(98℃)20min，PBS洗3×3min。3ml/LH2O2抑制內源性過氧化物酶，室溫20min，PBS洗3×3min，滴加二抗正常血清，室溫孵育10min，不洗切片分別滴加濃縮型兔抗人HIF-1α多克隆抗體(1∶150)、即用型CD105鼠抗人單克隆抗體于溫盒內37℃,1h，PBS洗3×3min，滴加二抗，溫盒內37℃，10min，PBS洗3×3min，DAB顯色8～10min，自來水終止反應，蘇木精襯染60s，水洗藍化，常規脫水樹膠封片。

1.2.2 結果判斷 HIF-1α，陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，采用二級計分法，即以染色強度與陽性細胞的百分比的乘積作為半定量標準：染色強度：0分為無色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色(深淺與背景色相對比)。陽性細胞所占的百分比：陽性細胞≤10%為1分；10%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強度與陽性細胞所占的百分比的乘積0～3分為陰性(-)；＞3分為免疫反應陽性(+)。

1.2.3 MVD計數 以CD105為血管標記物的MVD計數參照Weidner 等的標準,略改動。在低倍鏡下(100×)尋找整張切片中富含血管組織的“熱點”(hot spot)區,即棕黃染色密度最高的區域；在高倍鏡下(400×)計數其內的血管數目,每張切片上分別選擇3個不同高倍視野計數，結果取其平均值。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.0統計學軟件對結果進行分析，兩樣本均數比較行t檢驗，計數資料比較用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α和CD105的表達 HIF-1α和CD105染色的陽性細胞在組織中呈彌漫和(或)散在分布，HIF-1α著色部位主要在腫瘤細胞的細胞核或細胞質，CD105定位于腫瘤邊緣與腫瘤相關的毛細血管內皮細胞的細胞質，15例正常組織中HIF-1α和CD105均無表達；HIF-1α和CD105在14例癌旁組織中陽性表達率分別為21%(3/14)和29%(4/14)；在70例胃癌組織中的陽性表達率分別為61%(43/70)和68%(48/70)。兩者在正常、癌旁、癌組織中的表達呈升高趨勢，且癌組織與癌旁組織比較，癌組織與正常組織比較，其差異性均有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 HIF-1α和CD105表達陽性與胃癌臨床病理參數的關系HIF-1α和CD105陽性表達率與年齡、性別、腫瘤的分化程度均無明顯關系(均P＞0.05)。HIF-1α和CD105的表達均與胃癌的浸潤深度、臨床分期以及局部淋巴結轉移之間存在相關性(P＜0.05)。

2.3 HIF-1α與CD105蛋白表達的關系 51例胃癌中HIF-1α和CD105共同表達陽性者34例，共同表達陰性者13例，HIF-1α表達陽性而CD105表達陰性者9例，HIF-1α表達陰性而CD105表達陽性者14例。二者總符合率為92%，二者檢出情況差異無統計學意義(P＞0.05)。Spearman等級相關系數r＝0.285，P＝0.017，二者呈正相關性。

3 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤，它不僅嚴重影響患者及其家庭的生活質量，而且嚴重威脅患者的生命安全，早期發現和治療是最有效的方法。惡性腫瘤是一類細胞周期調控失調引起的疾病，是增殖和凋亡失控的結果。惡性腫瘤的快速生長首先必須有新生血管的長入為其提供營養支持，但許多研究也發現，惡性腫瘤內部實際上多處于缺氧狀態，而腫瘤細胞在此缺氧狀態下仍然可以保持高增殖狀態，這說明仍然存在其他的促增殖的機制存在。缺氧誘導因子(HIF-1α)是近年來發現的存在于惡性腫瘤中的生物因子，它對惡性腫瘤的啟動、發生和發展起著重要的作用[2-3]。HIF-1α是1992年在研究缺氧誘導的紅細胞生成素(EPO)基因表達時發現的，是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子，是一種受低氧誘導的具有高度敏感性轉錄因子，以異源二聚體的形式存在，由120×103的α亞單位HIF-1α和(91～94)×103的β亞單位(HIF-1β)組成。HIF-1α在多種人類腫瘤中過度表達，甚至在癌前病變中檢測到。本研究結果證明其在胃癌中亦表達活躍，提示胃癌細胞缺氧發生在血管生成之前，并進而促進腫瘤的惡性轉化。CD105是內皮細胞增殖的標志，最近的動物實驗及臨床研究表明，CD105在新生血管增殖活躍的新生組織及惡性腫瘤邊緣血管內皮細胞(即新生的血管內皮細胞)中高表達，而在大血管及正常組織血管內皮細胞上呈低表達或不表達。胃癌組織中HIF-1α和CD105的高表達提示兩種因子聯合檢測對胃癌的診斷、惡性評價及治療均有值得重視的價值。

[1]Fonsatti E,Sigalotti L,Arslan P,et al.Emerging role of endoglin(CD105)as a maker of angiogenesis with clinical potential in human malignancies[J].Curr Cancer Drug Targets,2003,3(6):427-432.

[2]Pugh CW,Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia:role of the HIF system[J].Nat Med,2003,9(6):677-684.

[3]KaurB,Khwaja FW,Severson EA,et al.Hypoxia and the hypoxiainducible-factor pathway in glioma growth and angiogenesis[J].Neuro-Oncol,2005,7(2):134-153.