小鵝瘟馬源高免血清的制備及應用*

李 琳,邵洪澤,任科研,毛文智,許志林,姚新華

(吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院,吉林長春 130062)

小鵝瘟馬源高免血清的制備及應用*

李 琳,邵洪澤,任科研,毛文智,許志林,姚新華*

(吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院,吉林長春 130062)

采用JLDA株小鵝瘟抗原,高免馬匹后經采血精制可獲得滴度為1∶64～1∶128的抗小鵝瘟高免血漿。通過胃蛋白酶消化-硫酸銨鹽析的工藝,得到小鵝瘟馬源高免血清。按0.5 mL/羽劑量共預防雛鵝52.48萬羽,按1 mL/羽～3 mL/羽劑量共治療感染雛鵝5.66萬羽,證實該抗血清效價高,對雛鵝的預防保護率為95.58%,對感染雛鵝的治愈率為92.87%,表明對小鵝瘟防治安全高效。馬采血量大,成本低,同時有效地避免了同源動物間其他疫病的感染和強毒的散播,較之用鵝作為血清來源動物經濟和社會效益顯著。

小鵝瘟;鵝細小病毒;馬源高免血清;制備;應用

*通訊作者

小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose parvovirus virus,GPV)引起的雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病,主要發(fā)生于1月齡內雛鵝和雛番鴨,以滲出性腸炎、小腸黏膜表層大片壞死脫落、腸道栓塞為特征性病變的一種烈性傳染病。該病病程短、傳染性強、病死率高,10日齡內雛鵝發(fā)病率和死亡率可達100%,在易感群中的致死率高達70%。近幾年,隨著吉林省養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展和品種交換,以及高密度飼養(yǎng)增加,小鵝瘟這種烈性傳染病廣泛的發(fā)生及流行,對養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的威脅。小鵝瘟的防制主要依賴于弱毒疫苗或滅活疫苗的免疫接種[1],鵝群一旦感染后,各種藥物治療除了防止繼發(fā)感染外,對改善病情無任何作用,惟一有效的治療辦法就是給感染鵝注射抗血清[2]。本研究研制出了小鵝瘟精制馬源高免血清,取得了理想的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫用馬 購自非疫區(qū),經檢查未見任何疫病的 3歲～8歲營養(yǎng)良好,健康馬12匹,體重約250 kg～300 kg。購進后隔離飼養(yǎng),驅蟲,檢疫。在隔離期間進行馬傳貧瓊擴試驗[3]和鼻疽菌素點眼試驗,均為陰性者方可用于制造本品。

1.1.2 試驗用雛鵝 1日齡雛鵝,購自吉林省農業(yè)科學院畜牧分院,不含小鵝瘟母源抗體,也未接種小鵝瘟疫苗的健康雛鵝。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原

1.2.1.1 水劑抗原 采用JLDA株,接種11日齡鴨胚,37.5℃條件下孵育,收集72 h～144 h之間死亡鴨胚胚液(羊水+尿囊液)。經細菌檢驗為陰性,滴度在10-5ELD50/0.2 mL以上者,作為免疫用水劑抗原,置冰箱內冷凍保存[4-6]。

1.2.1.2 油乳劑抗原 將濃縮的水劑抗原,經40 mL/L甲醛滅活后與油乳劑(97 mL白油,3 mL司班-80,2 g硬脂酸鋁,加熱溶解后 120℃高壓30 min后使用)按1∶1比例,進行高速攪拌制成油乳劑滅活抗原[7]。

1.2.2 免疫程序

1.2.2.1 基礎免疫 經檢驗合格的馬匹,即可進行基礎免疫;注射抗原3次,分別間隔10 d注射油乳劑滅活抗原25 mL/匹,注射部位以頸、肩部及身驅兩側為主,輪換注射,每個注射點的每次注射劑量不宜過多。

1.2.2.2 強化免疫 用濃縮的水劑抗原按25 mL/匹,皮下或肌肉注射,免疫后第15天采血,用瓊脂擴散試驗(AGP)測定效價。

1.2.3 血清抗體效價檢測 采用瓊脂免疫雙擴法,制備10 g/L生理鹽水瓊脂板,瓊脂板上打梅花形孔,孔徑為5 mm,孔距為3 mm,中間孔滴加小鵝瘟瓊擴抗原,周圍孔分別加被檢血清,同時設標準陰、陽性血清對照,放入濕盒內,37℃放置24 h～48 h觀察結果[8-9]。

1.2.4 采血 當免疫馬的小鵝瘟抗體效價達到標準后,開始從頸靜脈采血。局部徹底消毒,在無菌的條件下采血,采血量按17 mL/kg～19 mL/kg計算。10 000 r/min離心 10 min,抽取上清,同時加入50 mg氯仿或30 mg硫柳汞,加塞密封充分搖勻,每瓶血清應作詳細記載[10]。

1.2.5 抗小鵝瘟血清的精制 將要精制的血清混合于同一容器內,按血清量的2倍加入蒸餾水,充分攪拌均勻,用2 mol/L NaOH調整pH為3.5±0.1,然后按6 IU/mL～9 IU/mL加入胃蛋白酶和2 g/L甲苯,在29℃～31℃中消化2 h～24 h,消化期間要經常攪拌。消化完畢的溶液按150 g/L加入硫酸銨,溶解后用2 mol/L NaOH調整pH為4.6±0.1,然后用水浴方法加溫,使之達到57℃±1℃保持30 min,待溶液冷卻至43℃以下時,用帆布濾過,沉淀廢棄。收集的上清液盛于同一容器內,用2 mol/L NaOH 調整pH為 7.2±0.1后,加入1.2 mol/L的硫酸銨,充分攪拌使之溶解,然后用帆布濾過,清液廢棄。收集沉淀稱重,按量加入5倍～6倍蒸餾水,溶解后,按總量加入100 g/L的明礬溶液使明礬含量為10 g/L,用2 mol/L NaOH調整pH為7.7～7.8,靜置2 h～4 h使之沉淀。然后用帆布濾過,沉淀經水洗壓干后廢棄。將透明清液混合于同一容器中,按量加入1.2 mol/L硫酸銨,經攪拌溶解后用帆布過濾,上清廢棄,沉淀壓干后用透析袋分袋包裝。每包約200 g～250 g加少許氯仿,放置在流水槽進行透析48 h～72 h。收集袋內血清,按量加入5 g/L氯仿、9 g/L氯化鈉和30 mg硫柳汞,充分搖勻,溶解后用蔡氏澄清濾板濾過一次,濾液即為抗小鵝瘟血清。然后于5℃～15℃靜置沉淀。抗血清在靜置時期,每批抽取樣品作效價測定、無菌檢驗和安全性檢驗,合格者進行分裝[11]。

1.2.6 抗血清的檢驗

1.2.6.1 無菌檢驗 按生物制品無菌檢驗常規(guī)法進行,取1 mL抗血清,接種于馬丁肉湯和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h,觀察細菌生長情況。

1.2.6.2 安全檢驗 抗血清批次分別是090123,090212,090316,經檢驗抗體效價為1∶32～1∶64。1日齡易感鵝雛40只,生長發(fā)育良好,無小鵝瘟相應抗體,適應觀察2日進行試驗,在接種前核實鵝的全身狀況和臨床疾病情況。所有的鵝均健康,沒有任何鵝被排除在本試驗外。隨機均分為4組,即3個試驗組和1個對照組,試驗組分別用 090123,090212,090316批次的抗血清接種,接種劑量為0.5 mL/只,皮下或肌肉注射。觀察20 d,內容包括精神狀態(tài)、飲食欲、體溫等,記錄試驗結果[12]。

1.2.6.3 抗血清對雛鵝的保護試驗 強毒抗血清混合液:取0.1 mL小鵝瘟強毒液,加入0.9 mL的抗血清,置37℃水浴箱內感作2 h,即得所需。

強毒稀釋液:取0.1 mL小鵝瘟強毒液,加入0.9 mL的無菌生理鹽水,即得所需。

3日齡試驗用鵝雛60只,隨機均分6組,每批次抗血清2組,每組10只。第1組為試驗組,第2組為對照。試驗組用0.5 mL/只劑量接種強毒抗血清混合液1次,皮下注射;對照組用0.2 mL/只劑量接種強毒稀釋液,皮下注射1次。觀察飼養(yǎng)15 d,記錄結果。

1.2.6.4 保存期測定 將制備的抗血清隨機選取三個批次,每一批次的血清均保留3份,放置于4℃～8 ℃環(huán)境中保存,保存3個月、6個月、12個月、18個月、24個月。保存前后分別測其抗體效價,檢測方法選用AGP法。

1.2.6.5 臨床最佳預防劑量測定 將試驗雛鵝160只隨機均分4組,每組 40只。第 1組、第 2組、第3組均為試驗組,第4組為對照。試驗1組預防劑量用0.25 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗2組預防劑量用0.5 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗3組預防劑量用1 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;對照組不接種抗血清。5 d后分別使用JLDA株強毒攻擊,攻毒后觀察飼養(yǎng)20 d,記錄結果。

1.2.6.6 被動免疫保護期的測定試驗 3日齡試驗用鵝雛180只,臨床檢查健康,用0.5 mL/只劑量抗血清接種120只3日齡試驗雛,之后隨機均分6個試驗組,每組20只。試驗組分別于接種抗血清后第 3 天、第 5 天 、第 7 天、第 10 天 、第 12 天、第 15 天等時間用JLDA株強毒攻擊;對照組60只不接種抗血清,在各試驗組攻毒時同時攻毒,每次5只。攻毒后隔離觀察飼養(yǎng)15 d,記錄試驗結果。

1.2.6.7 臨床最佳治療劑量測定試驗 用JLDA株強毒10-6ELD50/0.2 mL接種130只3日齡試驗鵝,之后隨機均分4個試驗組,前3組為試驗組。每組40只,于第3天發(fā)病時開始應用抗血清。試驗1組治療劑量用0.5 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗2組治療劑量用1.0 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗3組治療劑量用2.0 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;對照組10只不接種抗血清。記錄試驗結果。

1.2.6.8 區(qū)域應用試驗 將生產的3批次抗血清產品,批號為090123,090212,090316。用于預防雛雞最終效價稀釋為32×,治療雛雞最終效價稀釋為64×并按規(guī)程進行檢驗合格,應用于長春、白城、松原、吉林、四平、遼源等地養(yǎng)鵝戶雛鵝。預防雛鵝524 800只,治療感染小鵝瘟發(fā)病雛鵝56 600只。對部分預防和治療雛鵝跟蹤隨訪,統計防治效果。

2 結果

2.1 抗血清檢驗結果

2.1.1 無菌檢驗結果 制備的高免血清在馬丁肉湯和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h,觀察未見細菌生長。肉湯清亮,鏡檢無菌。

2.1.2 安全檢驗結果 各組的試驗并沒有影響試驗雛鵝的精神狀態(tài)和飲食欲,全部健康成活,無手感體溫變化。剖檢部分試驗雛,注射部位吸收良好,無硬結、腫脹、潰爛等肉眼可見的外觀病理變化,各組織器官均無眼觀病理變化。

2.1.3 雛鵝保護試驗 試驗組全部存活;對照組全部死亡。

2.1.4 瓊脂雙擴散試驗 隨即抽取抗血清批號為090123,090212,090316,用標準抗原和陽性血清對其抗體檢測,結果表明抗小鵝瘟血清與小鵝瘟瓊擴抗原在24 h內出現清晰的沉淀線,效價分別為1∶32、1∶32和1∶64。

2.1.6 保存期測定結果 在4℃～8℃環(huán)境中保存,保存18個月其抗體效價沒有降低,證明抗血清在2℃～8℃條件下至少可保存18個月。

2.1.7 最佳預防劑量測定結果 接種抗血清后第5天用強毒攻擊,0.25 mL/只劑量組抗血清預防保護率為75%。0.5 mL/只和1.0 mL/只劑量組抗血清預防保護率均為100%。對照組全部死亡。0.5 mL/只劑量組可以作為臨床預防最小免疫劑量。

2.1.8 被動免疫保護期的測定結果 試驗雛鵝于注射抗血清后不同時間攻毒,第3、5、7 d攻毒各組0/20(死亡/存活),保護率為100%,對照組10/0(死亡/存活),保護率為0;第10 d組2/18(死亡/存活),保護率為 90%;對照組10/0(死亡/存活);第12和15天組保護率下降為75%～50%。剖檢對照組死亡鵝雛,有小鵝瘟典型病變。根據試驗結果,抗血清被動免疫保護期為7 d～10 d。

2.1.9 治療最佳劑量測定結果 試驗 1組0.5 mL/只死亡 15只,治愈 25只,治愈率為62.5%,治療效果較差。試驗2組1.0 mL/只治愈率為95%(38/40);試驗3組 2.0 mL/只治愈100%(40/40);對照組10只全部發(fā)病,臨床上呈現典型的小鵝瘟癥狀,在7 d內陸續(xù)死亡,死亡數為10/10。剖檢死雛均具有典型的小鵝瘟病特征性病理變化。故一次使用1.0 mL/只抗血清可作為臨床最佳治療劑量,治愈率為95%,對臨床癥狀較重和病程較長的雛鵝可增加使用劑量或間隔1日再注射一次抗血清。

2.1.10 區(qū)域應用試驗結果 在吉林省部分地區(qū)進行了抗血清的田間擴大試驗,用于預防雛鵝524 800只,使用劑量為0.5 mL/只,預防保護率為95.57%;治療雛鵝 56 600只,使用劑量為 1 mL/只～3 mL/只,早期治愈率為92.87%。

3 小結

通過抗體檢測和臨床應用結果表明,利用馬制備精制抗小鵝瘟血清是可行的。結果表明,馬源精制抗血清對初生雛鵝,用4倍量,試驗雛鵝無不良反應。抗血清注入雛鵝體內,馬上產生抵抗小鵝瘟病毒的可靠的免疫能力,起到被動免疫作用,皮下注射0.5 mL/羽,保護期達7 d～10 d,其保護率可達95.58%;對發(fā)病雛鵝群進行早期治療,皮下注射1 mL/只～3 mL/只,其治愈可達92.87%。該抗血清具有保護率、治愈率高,保存期長的特點。抗血清于4℃～8℃可保存18個月。區(qū)域試驗證明,本產品使用簡便、易于推廣應用。

[1]黃奇昌,程安春,汪銘書,等.小鵝瘟的研究——弱毒在雛鵝和成鵝體內分布和排泄[J].四川農業(yè)大學學報,1997,15(1):102-106.

[2]王明俊,冀錫霖.獸醫(yī)生物制品學[M].北京:中國農業(yè)出版社,1997:153-155.

[3]趙立平,許井君,朱遠茂,等.馬傳染性貧血瓊擴抗原生產工藝的改進[J].中國獸醫(yī)雜志,2005,41(4):44-46.

[4]Kisary J.Cross-neutralization tests on the parvoviruses isolated from gosling[J].Arian Parhol,1974,3:293-296.

[5]卡爾尼克B W.禽病學[M].北京:北京農業(yè)大學出版社,1991:427-444.

[6]殷 震,劉景華.動物病毒學[M].北京:科技出版社,1997:1145-1168.

[7]潘玉民,石全瑞,于為民,等.綿羊抗小鵝瘟高免血清(HPGP)的研究和應用[J].中國獸醫(yī)雜志,1995,21(4):51.

[8]劉和杰,張訓海,劉素梅,等.小鵝瘟瓊擴抗原的制備[J].安徽技術師范學院學報,2001,15(3):43-44.

[9]王洪新,劉學賢,穆海波,等.雞新城疫卵黃抗體IgY的分離提純研究[J].中國家禽,2003,25(19):11-14.

[10]王振輝,武桂梅,張桂榮,等.山羊抗雞新城疫病毒抗體的提純及免疫效果的研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43(8):21-23.

[11]范泉水,鄭 穎,張連江,等.新型精制抗蛇毒血清的制備[J].蛇志,2007,19(1):1-3.

[12]王文強,王開功,田新平.小鵝瘟羊源高免血清的制備及比較[J].貴州農業(yè)科學,2009,37(10):127-129.

Preparation and Application of Hyperimmune Serum Against Goose Parvovirus from Horse

LI Lin,SHAO Hong-ze,REN Ke-yan,MAO Wen-zhi,XU Zhi-lin,YAO Xin-hua

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science of Jilin,Changchun,J iLin,130062,China)

Hyperimmune serum against JLDA strain of goose parvovirus was obtained from horses.52.48 million goslings were immunized for prevention by injecting 0.5 mL of the hyperimmune serum per goose,and 5.66 million infected goslings were injected 1 mL-3 mL per goose for treatment.The protection rate was 95.58%,and the cure rate was 92.87%.The results showed that the hyperimmune serum is a highly effective and safe agent.Hyperimmune serum obtained from horses not only could effectively avoid the homologous animals being infected with other epidemic pathogens,but also could bring much ecnomic benefit,compared with hyperimmune serum from the goose.

Gosling plague;Goose parvovirus virus;hyperimmune serum from horse;preparation;application

S858.33

B

1007-5038(2010)09-0115-04*

2010-02-06

李 琳(1979-),男,吉林長春人,助理研究員,碩士,主要從事動物傳染病的診斷和防治的研究。