膠體金免疫層析技術在動物源性食品中的應用

祁光宇，智曉瑩，任維維，黃銀軍，牟克斌，劉學榮，王 宇，蔣 韜

（1.中農威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/農業部畜禽病毒學重點開放實驗室，蘭州 730046）

免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。它是繼三大免疫標記技術之后又一較為成熟的、得到廣泛應用的免疫標記技術。膠體金技術具有方便快捷、特異敏感、穩定性強、不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優點，因而特別適合于廣大基層檢驗人員以及大批量檢測和大面積普查等，具有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景，非常適用于動物源性食品的現場快速檢測。

1 免疫層析快速診斷試紙條工作的基本原理

免疫膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原抗體反應中的一種新型免疫標記技術。膠體金是由氯金酸水溶液在還原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，顆粒之間因靜電作用形成一種穩定的膠體狀態，也稱金溶膠。膠體金由于具有膠體穩定性、蛋白質強吸附性和高電子密度等特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而可用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中[1]。免疫膠體金技術最初僅用于免疫電鏡技術，現已發展到被動凝集試驗、光鏡染色、免疫印跡、斑點金免疫滲濾法以及免疫層析技術等。目前主要有四種方法用于快速診斷技術：①雙抗夾心法：用于檢測病原微生物性的大分子抗原的檢測[2-3]；②競爭法：用于檢測小分子抗原[4-6]；③雙抗原夾心法：用于檢測特異性的抗體[7]；④反向流動層析法：此法可以同時檢測同種病原微生物的抗體IgG和IgM[8]。此外還有雙面試紙條法、間接法和捕獲法，后兩種方法在免疫層析試驗中應用較少。目前，該技術已廣泛應用于臨床診斷、病原微生物的檢測和獸藥殘留。

2 膠體金免疫層析技術在動物源性食品檢測中的應用

膠體金免疫層析技術在生物醫學上應用較多，在動物源性食品檢測領域的應用是近幾年才發展起來。國內的研究主要集中在疾病診斷領域，對在動物源性食品檢測方面應用的研究剛剛開始。

2.1 在動物源性食品質量控制領域的應用

對于那些不需要精確定量檢測，但需要快速得出檢測結果的成分分析，膠體金免疫層析技術尤為適用。

牛初乳IgG含量成為評價牛初乳及其制品生物活性的良好指標。李忠秋等采用膠體金標記的標準牛IgG作為競爭抗原[9]，將其包被在試紙條的結合墊上，將自制的兔抗牛IgG抗體固相化在硝酸纖維素膜的檢測區。通過牛乳樣品中的IgG跟膠體金標記的標準牛IgG競爭結合IgG抗體的結合位點，來反映樣品中IgG的水平。該操作所需時間短，可以進行簡單的半定量分析，具有良好的特異性。

2.2 在動物源性食品病原微生物檢測領域中的應用

動物源性食品安全是一個重要的公共衛生問題。不僅給畜牧業生產直接造成損失，也嚴重影響個人、家庭、社會、商業及整個國家的經濟利益。因此，為了使用安全的動物源性食品，必須從飼養到餐桌全過程采取綜合措施，切實做好畜產品安全質量監測，確保生產安全畜產品。由于膠體金免疫層析技術操作簡單、檢測時間短、便于現場操作，可以為現場執法帶來科學依據。

2.2.1 免疫膠體金技術在動物源性食品病毒病診斷中的應用

目前，一些不法商販在食品行業競爭過程中采用不正當手段，活體帶病動物和食用性動物胴體致病菌的超標、農藥獸藥等的殘留、違禁物質的添加等問題層出不窮，給食品安全問題帶來了嚴重的隱患。由于金標試紙條的診斷具有快速性和準確性的優點，也開始被逐漸應用于畜禽病毒病的現場檢測。

鄭鳴等用膠體金標記抗原和雙抗原夾心法建立的豬瘟病毒抗體檢測免疫層析試紙條，它可以用來豬瘟的臨床診斷，這種檢測方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，并且能區分強弱毒感染[10]；Da等用膠體金標記AIV重組核蛋白制備試紙條，用于檢測AIV抗體，試紙條與血凝抑制（HI）試驗相同，比瓊脂糖凝膠擴散試驗敏感[11]；王慧杰等用膠體金標記PCV-2重組Cap蛋白制備膠體金快速診斷試紙，建立檢測豬圓環病毒2型Cap抗體的方法[12]。試驗結果表明該試紙特異性高，能夠區分PCV-2的標準陰、陽性血清。用該試紙在檢測來自不同豬場的165份送檢疑似血清中與美國間接免疫熒光檢測試劑的符合率為85%以上；蔣韜等建立了口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型診斷膠體金免疫層析試劑盒，研制的口蹄疫定型試劑盒具有良好的靈敏度，可檢測到7.8×104LD50（1：128稀釋乳鼠毒）的病毒量[13]。同時對陽性及陰性樣品進行3次重復檢測結果完全相同，具有較好的重復性。特異性試驗證實該方法在檢測口蹄疫臨床癥狀相似病原時無交叉反應，試劑盒對206份已知血清型田間及實驗室樣品的符合率試驗，O、A、AsiaⅠ型和陰性樣本的符合率分別為92.45%、91.66%、92.75%、100%，定型準確率94.58%。此外，如雞新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎病、雛鵝新型病毒性腸炎等多種疫病的膠體金診斷試紙條也相繼研制出來，這給畜禽病毒病的現場檢測提供了良好手段。

2.2.2 免疫膠體金技術在動物源性食品細菌病診斷中的應用

動物性食品中常見的致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、霍亂弧菌等[14]。

杜玉萍等以金黃色葡萄球菌菌體抗原免疫家兔獲得多克隆抗血清，采用膠體金免疫層析技術二步法檢測金黃色葡萄球菌，靈敏度為1×106cfu·mL-1[15]；刁琳琪等用雙抗體夾心法的原理，以膠體金標記一株單抗制備的試紙條可快速篩選標本中的大腸桿菌O157，試紙條檢測條靈敏度可達105cfu·mL-1，且特異性較高[16]；唐景峰等建立診斷布病的膠體金免疫層析方法體金標記單抗，以多克隆抗體作為檢測線檢測布病，該種方法與PCR檢測符合率為100%[17]；何艷玲等研究了膠體金免疫層析法檢測水產品中O1群霍亂弧菌的方法[18]，該方法檢測食品中O1群霍亂弧菌的靈敏度為105cfu·mL-1，與食品中常見的致病菌無交叉反應，準確性高，適用于食品的快速檢測。膠體金技術在動物源性食品細菌病診斷中的作用已經越來越突出了。

2.2.3 免疫膠體金技術在動物源性食品寄生蟲診斷中的應用

大多數寄生蟲病是人獸共患性疾病，因此，對畜禽寄生蟲病的早期快速診斷具有很重要的公共衛生學意義。彭運潮等利用雙抗原夾心法，以日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（(SEA）為檢測抗原研制的試紙條，與ELISA檢測結果比較，兩種方法具有良好的一致性[19]。秦銀霞等以膠體金標SPA和旋毛蟲肌幼蟲ES抗原制備免疫層析試紙條，試紙條對鄉土旋毛蟲、布氏旋毛蟲、偽旋毛蟲及納氏旋毛蟲感染動物血清檢測的陽性率均為100%，適合于動物旋毛蟲感染的快速血清學診斷[20]。王艷華等將抗弓形蟲抗體和弓形蟲分泌抗原用膠體金標記后，制備檢測弓形蟲抗體的免疫膠體金快速試紙條，對已知弓形蟲陰性、陽性血清檢測，結果與IHA檢測結果的符合率為82.5%，而且敏感度高于IHA[21]。

2.3 在動物源性食品獸藥殘留領域中的快速檢測應用

現在獸藥殘留引起食物中毒和影響畜禽產品出口的報道越來越多。藥物殘留不僅可以直接對人體產生急慢性毒性作用，引起細菌耐藥性的增加，還可以通過環境和食物鏈的作用間接對人體健康造成潛在危害。近年來免疫膠體金技術在獸藥殘留快速檢測中的應用越來越廣泛。

陳小旋[22]用雜交瘤技術制備了3株分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體雜交瘤細胞株，并在此基礎上建立了克倫特羅金標檢測試紙條。試驗表明，該試紙最小檢出限為10 μg·kg-1，適合非專業人員在屠宰現場檢測鹽酸克倫特羅。王自良等以BSA-CAPHS免疫Balb/C小鼠，用細胞融合技術篩選抗氯霉素單克隆抗體（CAPmAb）雜交瘤細胞，體內誘生腹水法制備CAPmAb，研制CAP殘留快速檢測金標試紙（CAP-StriP），與其他酞胺醇類和抗菌素類藥物無交叉反應，目測檢測限為0.5 μg·L-1[23]；其敏感性與競爭ELISA試劑盒相當符合率為100%；朱繼帥采用單克隆抗體技術和膠體金免疫層析技術，合成并制備了鏈霉素人工抗原、抗鏈霉素單克隆抗體和膠體金，采用競爭法建立了鏈霉素膠體金免疫層析試紙條[24]。試驗表明，該試紙條檢測鏈霉素的靈敏度達200 ng·mL-1，對新霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、阿米卡星、恩諾沙星、氨芐青霉素、磺胺哇嗯琳的交叉反應率均小于0.1%，能基本滿足鏈霉素殘留檢測的需要。

2.4 在動物源性食品其他殘留領域的快速檢測應用

動物源性食品中違禁藥物（如β-激動劑、激素等）的殘留、重金屬和生物毒素含量超標已成了困擾世界食品衛生的難題。這些殘留不僅影響我國畜禽產品的出口貿易，同時威脅著消費者的健康。許多國家以獸藥殘留監控為技術壁壘，阻止我國畜產品的正常出口。

利用免疫膠體金快速診斷來初測農畜產品中的重金屬離子含量，可以節省時間，大大加快檢測進程，提高現場抽查和快速通關檢測的效率。目前，國內外已經建立了針對有機污染物的免疫膠體金檢測方法，并且將該方法用于重金屬離子的分析檢測，迄今為止，免疫膠體金檢測技術已經成功用于水中的銦、汞、鎘、鉛和鈾等的檢測。

在毒素檢測方面，膠體金試紙條也顯示出它的優勢。賴衛華等研制的膠體金試紙條用以檢測赭曲霉毒素A，檢測限為10 ng·mL-1[25]。Klewitz等利用膠體金標記技術，分別研制了檢測A、B、D、E型肉毒毒素的試紙條，試驗的敏感性甚至達到50 pg·mL-1[26]。

近年來，由于國家加強對“瘦肉精”克倫特羅的監控，有效打擊了生豬養殖中非法使用“瘦肉精”的行為。但是在養殖業中，“瘦肉精”的替代品萊克多巴胺（Ractopamine，RCT）和沙丁胺醇卻又悄然興起。徐社會將萊克多巴胺（RAC）與BSA偶聯制成人工抗原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術制備了抗RAC單克隆抗體，并利用膠體金免疫層析技術，采用競爭法研制了RAC膠體金免疫層析試紙[27]。試驗表明，該試紙檢測靈敏度為5 ng·mL-1，在室溫干燥條件下可保存12個月以上，與克倫特羅、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺的交叉反應性都小于0.03%，試紙靈敏度、穩定性、特異性等均達到檢測要求。

3 展望

免疫膠體金技術以其簡便快速，特異性強、敏感性高，肉眼判斷，試驗結果易保存，無需特殊儀器設備和試劑等優點，這些特點都是其他免疫學方法所無法比擬的。但膠體金免疫技術在實際研究及應用過程中仍存在一些不足之處：首先，該方法在檢測過程中常出現假陽性和假陰性問題[28]。其次，檢測的靈敏度及可重復性程度不高，檢測范圍需要進一步擴展。最后，因免疫膠體金技術是以膠體金納米顆粒作為標記物，顆粒本身的一些特性也導致免疫膠體金技術的應用受到一定限制，如在操作過程中要求清潔程度高，膠體金溶液的穩定性較差，存放時間短，膠體金顆粒大，滲透能力較差等[29]。免疫膠體金技術應在解決這些問題的基礎上向以下幾方面發展：首先，進一步提高檢測靈敏度，拓寬檢測范圍。為放大特異性抗原抗體的反應信號，增強膠體金的顯色效果，可采用生物素親和素系統（BAS）或免疫金銀染色法（IGSS）等措施，并結合一些相應的生物傳感器、電化學設備來拓寬其檢測范圍[29]。Tang等基于鉑金電極修飾的膠體金提高了生物傳感器檢測HABS表面抗體的敏感性和穩定性[30]。Kitano等用基于膠體金表面等離子共振效應的電感受器測定胃蛋白酶的親和常數。其次，實現檢測多元化[31]。可采用多膜復合或單膜多元受體固定兩種方式，一次檢測可同時得到一組結果，節省檢測時間及成本，這對于檢測某些具有聯檢意義的物質具有很大的應用價值。進一步提高免疫金標方法的敏感性、特異性，并實現多元檢測、定量或半定量檢測是將來該技術發展的主要方向。隨著免疫膠體金新的標記物和制備方法的發展，免疫膠體金技術將會有更為廣闊的市場和應用前景。

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