實時定量PCR在植物真菌病原體定量檢測中的應用

李鳳蘭，李學湛，閔凡祥，韓 峰，魏 琪，馮艷忠，郭 梅*

（1．東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2．黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3．黑龍江省農業科學院畜牧研究所，哈爾濱 150010）

實時定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RQ PCR）是一種在常規PCR基礎上運用熒光能量傳遞（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FR-ET）技術，在反應體系中添加熒光標記探針，從而巧妙地將核酸擴增與雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起的檢測技術。這項技術無需常規PCR后的操作，同時還可以利用反應過程中的熒光探針所發出的熒光的變化對擴增過程進行實時監測[1]。因此，這種技術以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、閉管操作無交叉污染，并可同時檢測同一樣品中的多種靶序列的優點成為植物病理學研究中的重要方法之一[2]。在植物病原菌檢測研究中，實時PCR不僅在植物的病毒性病害[3-5]、線蟲病害[6-9]和細菌病害[10-13]的快速檢測中得到了充分的應用，并且在植物真菌病害的檢測研究中也得到了快速發展。相對常規PCR而言，實時PCR具有顯著優勢。這種技術避開了過度擴增步驟，大大減少了實驗時間和勞動力投入，從而增加了PCR實驗的處理量，成為進行大規模分析的自動化檢測系統。在定量PCR的鑒定過程中常采用兩種主要策略來檢測和鑒定真菌小種或菌株的專一性靶序列：①對保守基因進行擴增和測序，保守基因一般是對于所有的真菌都具有的基因，而引物采用通用引物；②采用非專一性隨機引物擴增未知基因區域[14]。

1 植物真菌病原體定量PCR檢測方法及影響因素

在真菌基因組中，核編碼核糖體RNA基因（rDNA）是高度保守的，這為鑒定不同真菌小種提供了一個最佳的靶序列，可以采用通用引物對這些序列進行擴增和測序[15]。根據rDNA的保守區域設計的探針和引物可以對小種、家族，甚至界中相同的核糖體基因進行鑒定[16]。在不同病原真菌中檢測到特異DNA片段序列還可以用于不同真菌小種的鑒定。在變化的區域中，ITS是真菌中最廣泛使用的鑒定序列[17-19]。本研究組在對馬鈴薯的鐮刀菌進行定量檢測研究過程中，利用不同致病小種的ITS區域保守基因特異性序列設計了熒光探針，成功的對黑龍江省馬鈴薯干腐病的6個主要致病小種及變種進行熒光定量檢測。結果表明，采用ITS區域設計引物可以有效的對不同的鐮刀菌小種進行鑒定。

要對植物真菌的靶DNA進行準確、可靠和高流通量的定量就需要采用實時PCR的方法。特別是多重PCR（Multiplex PCR）的應用大大提高了實時PCR對植物真菌病原體定性和核酸含量定量的檢測能力。這種技術就是在一個反應管中同時加入多對不同PCR引物和相應的模板，可在同一反應管中同時擴增出一條以上的目的基因，進行同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上有其獨特優勢和很高的實用價值，并能大大提高精度節約成本[20]。這種方法可以同時對多個模板進行鑒定，這種特性大大的推進了實時PCR在植物真菌病害病原菌規?；瘷z測中的應用潛力。Winton等采用標有不同熒光基團TaqMan探針同時檢測出花旗松（Douglas fir）和病原體Phaeocryptopus gaeumanii的DNA[21]；Ippolito等采用兩個不同蝎形引物在一個單管中同時鑒別了兩種根霉病原菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora citrophthora）[22]。此外，在常規PCR檢測操作過程中，反應結果常受一些天然化合物，例如腐殖酸、鞣酸、木質素混合物等抑制因素的影響，原因是這些抑制因素對PCR反應過程中后期的循環（這些循環對后期產物積累是非常關鍵的）產生影響。但是在實時分析過程中，這些物質的影響卻很小，因為實時定量的試驗結果并不依賴于PCR產物的積累，而是通過早期階段熒光信號的產生來實現的[23]。

在使用實時PCR方法對植物真菌病原體進行定量分析時，還存在著一定的局限性，主要是這種方法不能對樣本中生活和死亡病原菌的核酸進行鑒別，因此，在對天然樣本進行定量分析時，可能會出現檢測結果不確定性[24]。有報道表明，在土壤中核酸會被DNA酶快速降解[25]。核酸酶廣泛的分布在環境中，并且在微生物死亡后可以將病原菌的DNA降解掉，但是微生物DNA的降解率在很大程度上依賴于環境條件。有研究發現褐座堅殼菌（Rosellinia necatrix）的DNA在土壤中很快被降解，從而降低了檢測結果的假陽性可能性[18]，但是，也有研究表明，土壤中一些化合物可以使DNA在土壤中保持很長時間[26]。為了避免檢測到死細胞中DNA而出現假陽性的現象，現在發展起來一種將實時PCR與生物學相結合的技術，即BIO-PCR技術[27]。它不僅增加微生物的生物學擴增的檢測敏感度，同時又可以避免從復雜環境樣本（如土壤）中提取DNA的問題。這項技術已經對存在于自然土壤中絲核菌（Rhizoctonia solani）[17]和根霉病原菌（Phytophthora nicotianae）[28]進行檢測，并取得了較好的效果。

2 土壤棲息的植物真菌病原體定量檢測

由于實時PCR的可實時檢測性，這項技術也被應用在土壤中真菌病原菌DNA的檢測中。Landeweert等從含有多種微生物土壤樣品檢測出兩種外生菌根真菌（Suillus bovinus和Paxillus involutus），并且在研究中發現，隨著時間的發展S.bovinusDNA的量增加，而P.involutusDNA的量減少[29]。陶萌等采用實時熒光PCR技術對土壤中粉紅粘帚霉高效生防菌株6721進行了定量檢測，結果表明，所建立的PCR檢測方法靈敏度高、快速實用，相對于以稀釋涂板法為代表的傳統方法省時、省力、準確性高，而且適合生態學研究的要求[30]。另外，實時PCR技術也被應用在土壤中茄長蠕孢（Helminthosporium solani）[31]，炭疽菌（Colletotrichum coccodes）[32]， 粉 痂 菌（Spongospora subterranea）[33]，腐皮鐮孢菌（Fusarium solanif.sp.Phaseoli）和灌木菌根真菌[34]、褐座堅殼菌（Rosellinia necatrix）[18]、疫霉病菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora citrophthora）[22]等真菌 DNA 檢測中。

Ippolito等在對土壤中的Phytophthora nicotianae進行定量分析時發現，病原體在選擇性培養基（繁殖體/每克土壤）上的接種密度和Ct值之間存在強關聯性[28]。因此，實時PCR可以檢測土壤菌量閾水平范圍，這種菌量閾水平可以預測病原菌在土壤中的潛在發展趨勢，因此，可以利用這項技術進行預測性的診斷試驗，如果某塊田地土壤中病原菌的菌量超過了閾值，就可以確定其為高發病的田地，因此，對土壤中病原菌進行定量分析顯得極其重要。另外，在進行殺菌劑劑量選擇時，可以將土壤中的真菌繁殖體的閾水平作為依據。例如在柑橘類植物中，如果對于根莖而言，疫霉的數量高于15～20個繁殖體·g-1土（ppg）時確定為易感的，并且高于30 ppg時確定為有抗性的，在這種標準下確定殺菌劑的施用方案也更為經濟合理[35]。

3 實時定量PCR對寄主組織中真菌D N A的定量檢測

對寄主組織中植物病原體的寄生率進行定量和評估也是實時PCR一個非常有價值的應用。據報道，研究者已經成功對馬鈴薯中的茄長蠕孢（Helminthosporium solani）、炭疽菌（Colletotrichum coccodes）和 VA 菌根真菌（Glomus mosseae），具有廣泛寄主的晚疫病菌（Phytophthora infestans）和柑桔褐腐疫霉（Phytophthora.Citrophthora）[36]，大豆種子中的潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum和Phomopsis longicolla）[37]，不同寄主根和樹皮中的褐座堅殼菌（Rosellinia necatrix）[18]，柑桔根中的疫霉病菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora.citrophthora）[22]，被感染的大麥種子上的網斑病菌（Pyrenophora teres）[38-39]，玉米，胡椒和辣椒上的黃曲霉菌（Aspergillus flavus）[40]等真病原菌進行了有效的定量分析。Winton等利用兩個標有不同熒光集團的探針，同時對寄主花旗松（Douglas fir）和病原菌（Phaeocryptopus gaeumannii）DNA 進行定量[21]。在這個試驗中，寄主DNA被當作定量檢測的一個內參，這個內參可以作為一個內在的陽性對照，這種內參可以修正由于DNA提取和PCR過程中樣品不同帶來的差異，同時，他們又將實時PCR檢測的方法同子實體豐度法（Fruiting Body Abundance）、麥角固醇含量法（Ergosterol Content）和免疫印跡法（Dot Blot Analysis）等方法進行了比較，發現TaqMan實時PCR對冷杉（Douglasfir needles）體內的真菌相對增長量的計算更準確[41]。胡浩等利用常規PCR和TaqMan探針法、SYBRGreenI熒光染料法兩種熒光定量PCR兩種方法對柑桔體內的黃龍病病菌的變化動態進行檢測，結果表明熒光定量PCR方法的靈敏度比常規PCR高出至少2～3個數量級，確定TaqMan探針法更適合于柑桔黃龍病的檢測[42]。

由于高靈敏性和重復性，實時PCR也是檢測寄主抗性和易感性微小變化的理想方法。Qi等采用實時PCR的方法準確評估水稻的稻瘟病抵抗水平，結果表明，在葉片出現損傷時，在易感染的植株中稻瘟病病菌的增長比抗性品種高80倍[43]。Hietala等在挪威云杉（Picea abies）上接種了異擔孔菌（Heterobasidion annosum），結果表明，在具有高度抗性的植物體上真菌DNA是非常有限的，并且只局限于侵害部位，而在低抗性的植物體上，在出現損害癥狀之前，真菌DNA已經可以被檢測到[44]。

4 結語

隨著實時定量PCR技術的快速發展和大量實驗經驗的積累，特別是這項技術所表現出來的敏感性、快速性和通用性，推動了它在植物真菌研究中快速和廣泛發展的進程。實時PCR可以精確的對一些植物真菌病害特性進行研究，相對于常規PCR而言，實時定量PCR分析可以獲得一些重要的關鍵性信息，對于研究寄主-病原菌之間互作機制、病原菌同環境互作機制和mRNA的定量等過程中表現出了其他檢測技術無法比擬的優勢。雖然，相對常規PCR，應用在實時PCR中的引物和熒光探針的數量是有限的，但是，在將來會有越來越多的引物和探針被發展起來，特別是隨著人們對真菌基因組認識的增加，傳統PCR診斷技術不斷的完善，這些研究基礎為實時PCR檢測快速發展提供了強有力的保障。因此，在檢測的常規服務中實時PCR必將成為大規模診斷植物病害致病真菌的標準方法。

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