納米銅毒性研究進展*

荔 霞,劉永明,齊志明,董書偉,劉世祥,王勝義,萬玉林,劉 旭

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅蘭州 730050;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州 730046;3.甘肅省動物疾病預防控制中心,甘肅蘭州 730046)

納米銅毒性研究進展*

荔 霞1,劉永明1,齊志明1,董書偉1,劉世祥1,王勝義1,萬玉林2,劉 旭3

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅蘭州 730050;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州 730046;3.甘肅省動物疾病預防控制中心,甘肅蘭州 730046)

納米銅的誕生給畜牧獸醫(yī)行業(yè)、飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來技術上的革命。然而由于納米材料獨特的納米效應,導致納米銅可能對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)帶來損害,其生物安全性資料極為匱乏,因此必需加強其危險性評估。論文介紹了納米材料、納米銅的基本概念、一般毒性、系統(tǒng)毒理學研究方法的優(yōu)勢及策略,以及毒理蛋白質(zhì)組學研究,提出了納米銅應用及研究中存在問題及研究趨勢,為納米科學健康可持續(xù)發(fā)展提供依據(jù)。

納米材料;納米銅;毒性;蛋白質(zhì)組學

1928年發(fā)現(xiàn)銅是動物日糧的必需成分以來,微量元素銅營養(yǎng)的研究越來越被重視。近年來納米銅的誕生,給畜牧獸醫(yī)行業(yè)、飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來技術上的革命。然而,由于納米材料的特殊性,容易與生物體中的組織(器官)、細胞、細胞器、蛋白質(zhì)和生物大分子等相互作用,可能造成細胞和組織的功能異常而影響生物體健康,也可能通過食物鏈而破壞生態(tài)系統(tǒng)。納米銅的一般毒性已有研究,其蛋白組毒理學作用機制鮮見報道。因此,必須加強對納米銅毒性的認識和研究,為納米銅的合理利用提供依據(jù)。

1 納米材料及納米銅概述

納米科學被認為是21世紀的三大支柱科學領域之一,隨著納米科技的迅猛發(fā)展,人造納米材料(manufactured nanomaterials,MNMs)已被廣泛應用于日常消費品、醫(yī)藥、電子、航天等多個領域。納米級結構材料簡稱為納米材料(nano material),一般指至少有一個維度尺寸在1 nm～100 nm范圍,并且出現(xiàn)納米效應(如獨特的光學、熱學、磁學、力學、電學、聲學、化學),尤其是以應用為目的而人為制造的材料如碳納米管等[1]。按材質(zhì),納米材料可分為納米金屬材料、納米非金屬材料、納米高分子材料和納米復合材料。納米銅是代表性的金屬納米材料之一,已經(jīng)作為商業(yè)化產(chǎn)品進入市場多年。納米技術的誕生給畜牧獸醫(yī)行業(yè)、飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來技術上的革命。納米銅在生命科學領域主要用于獸藥、畜禽類飼料添加劑、免疫佐劑的制備及研究,在生物醫(yī)學領域、工業(yè)領域以及其他領域也有廣泛的應用。

2 納米銅的一般毒性研究

納米銅的廣泛應用,導致它們在生產(chǎn)、加工等環(huán)節(jié)被釋放到外界環(huán)境,或者經(jīng)呼吸道、皮膚、飲水、醫(yī)藥等途徑進入人體的機會在不斷增加。由于納米尺度上物質(zhì)的特殊性質(zhì),它們對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)有可能帶來嚴重損害,但是人造納米材料的生物安全性相關數(shù)據(jù)極為匱乏,這與納米科技的飛速發(fā)展極不協(xié)調(diào)。因此,必需加強對它們的危險性評價,合理駕馭納米科技,使之造福而不傷害人類。

目前,國內(nèi)外對納米材料、納米銅的生物安全性及其機制已經(jīng)展開了初步的探討,結果顯示無論是對人類或生態(tài)系統(tǒng),納米銅潛在的毒性均不容忽視。小鼠納米鋅(58 nm±16 nm)經(jīng)口急性毒性研究發(fā)現(xiàn),5 g/kg納米鋅染毒組,10%小鼠因腸道梗阻而死亡,心臟、肝臟和腎臟是納米鋅的靶器官,納米鋅還可致嚴重的貧血、嘔吐、腹瀉等輕度胃腸道炎癥狀。小鼠納米TiO2(25 nm,80 nm)經(jīng)口急性毒性研究結果顯示,5 g/kg染毒劑量可致心肌、肝臟和腎臟不同程度受損[2]。研究報道經(jīng)其它途徑暴露于機體的人造納米材料也可能被吸收入血繼而經(jīng)血液循環(huán)到達肝臟和腎臟。肝臟和腎臟是外源化合物進行生物轉(zhuǎn)化及排泄的重要器官,因此也成為外源化合物或藥物誘導毒性的主要靶器官。Chen Z等報道[3]小鼠納米銅(23.5 nm)和微米銅(17 μ m)經(jīng)口急性毒性研究結果顯示,納米銅的LD50為413 mg/kg,而微米銅的LD50大于5 000 mg/kg,結果表明其毒性呈現(xiàn)出“顆粒越小毒性越大”趨勢。Henry T B等[4]研究發(fā)現(xiàn)80 nm的銅粒子對斑馬魚具有急性致死性,納米銅在魚體內(nèi)的毒性可能是兩種形態(tài)的銅(粒子銅和離子銅)共同發(fā)揮作用的結果。因此,納米銅對人類健康和環(huán)境的潛在危害是不容忽視的。

3 系統(tǒng)毒理學研究優(yōu)勢及策略

目前納米銅毒性毒理學存在的主要問題是研究資料不深入、不系統(tǒng),主要體現(xiàn)在研究局限在急性毒性評價方面,對毒性機制的揭示不全面,因缺乏有效的機制假設,在短期內(nèi)揭示帶有普遍意義的損害機制仍很困難,因此開展毒性毒理研究是當務之急。納米藥物毒性研究主要采用體內(nèi)和體外評價試驗,通過檢測血清酶學、肝功能、肝臟化學組分以及組織病理學的改變來反映藥物對動物整體或體外培養(yǎng)肝細胞的毒性作用性質(zhì)和強度,研究其毒性機理。雖然這些方法在技術上比較成熟,但在納米藥物研發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)階段,采用這些方法仍存在一些不足:缺乏理想的評價納米藥物毒性的動物模型;由于物種間存在生理、解剖和代謝方面的差異,采用這些方法所研究的動物試驗結果并不能很好預測人體的毒性反應;對于毒性作用完全未知的化合物的毒性作用機制缺乏潛在的預測性。

生物體是一個復雜系統(tǒng),將在基因、蛋白質(zhì)、代謝物等不同水平上觀察到各種相互作用、各種代謝途徑、調(diào)控通路的改變整合起來能更加全面、系統(tǒng)地闡明復雜的毒性效應。伴隨著“組學”(omics),如基因組學(genomics)、蛋白質(zhì)組學(proteomics)、代謝組學(metabonomics)等技術的發(fā)展,系統(tǒng)毒理學應運而生。系統(tǒng)毒理學通過了解機體暴露后在不同劑量、不同時點的基因表達譜、蛋白質(zhì)譜和代謝物譜的改變以及傳統(tǒng)毒理學的研究參數(shù),借助生物信息學和計算毒理學技術對其進行整合,從而系統(tǒng)地研究外源性化學物和環(huán)境應激等對機體的影響。系統(tǒng)毒理學采用基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術,為在全局范圍內(nèi)從基因、蛋白質(zhì)、內(nèi)源性代謝物等不同分子水平上進行納米藥物毒性研究提供了新的有力手段,NMC毒性研究也隨之上升到了一個新水平。

4 蛋白質(zhì)組學概念及研究技術

4.1 蛋白質(zhì)組學概念

1994年Wilkins等首先提出了“蛋白質(zhì)組”的概念,揭開了蛋白組學研究的序幕,蛋白組學是以蛋白質(zhì)組為研究對象,研究機體的蛋白質(zhì)組成、表達,了解蛋白質(zhì)之間的相互作用,探索蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律的一門新興學科[6]。蛋白質(zhì)組學技術的應用為疾病的發(fā)生、發(fā)展機制及診療方法的研究提供了新的手段。何慶華等[7]認為蛋白質(zhì)組學(proteomics)是一門在蛋白質(zhì)水平對疾病機理、細胞模式、功能聯(lián)系等方面進行探索的科學。程彥偉等[8]指出,蛋白質(zhì)組學就是指細胞在其生命活動過程中基因組表達的所有蛋白質(zhì),以及表達后的修飾,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測、細胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能。蛋白質(zhì)組學的研究是聯(lián)系細胞基因組以及細胞行為之間很好的橋梁。綜上所述,蛋白質(zhì)組學就是以蛋白質(zhì)組為研究對象,以蛋白質(zhì)性質(zhì)研究為基礎,探索機體的蛋白質(zhì)組成、差異表達、定性鑒定、定量檢測及蛋白質(zhì)之間的相互作用,并對疾病發(fā)生機理、蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律進行研究的一門新興學科。

4.2 蛋白質(zhì)組學研究技術

蛋白質(zhì)組學研究技術主要包括樣品制備技術、蛋白質(zhì)分離技術、蛋白質(zhì)鑒定技術以及生物信息學技術。目前常用的樣品處理技術有液相等電聚焦、膜電泳、吸附色譜、亞細胞分級、激光捕獲顯微解剖技術、非電荷還原劑及酶抑制劑的使用、連續(xù)多步提取方法、變形劑及表面活性劑。①蛋白質(zhì)分離技術:雙相凝膠電泳技術,固相梯度等電聚焦技術,毛細管電泳技術,高效液相色譜技術等。吳少瑜等[9]用高效液相色譜法從江浙蝮蛇蛇毒中分離出一種新的組合,并命名為AHP-4,純度在98%以上,分子質(zhì)量為7.554 ku。②蛋白質(zhì)鑒定技術:表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜,電子噴霧電離質(zhì)譜測量法,基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜,同位素標記親和標簽技術,氨基酸組成分析。唐朝暉等[10]應用質(zhì)譜鑒定技術對紫杉醇誘導凋亡的膽管癌QBC939細胞差異蛋白進行鑒定,發(fā)現(xiàn)11個與細胞凋亡相關的差異蛋白點,提示紫杉醇是通過多個重要蛋白,發(fā)揮其誘導細胞凋亡的抗癌作用機制的。

4.3 納米銅毒理蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)組學技術是系統(tǒng)毒理學采用的主要技術之一,利用蛋白質(zhì)組學技術進行毒理學研究,即毒理蛋白質(zhì)組學(toxicoproteomics),是系統(tǒng)毒理學研究的一部分。毒理蛋白質(zhì)組學技術利用全蛋白質(zhì)表達分析技術來確認生物體系中受有害化學物和環(huán)境因素影響的關鍵蛋白質(zhì)和信號通路。蛋白質(zhì)組學技術在毒理學研究中的應用包括3個方面,一是機制性研究,即從蛋白質(zhì)角度研究外源性化合物對機體可能的毒性作用機制;二是篩選與預測毒作用靶標,即篩選特定的蛋白質(zhì)作為外源性化合物危險性評價的生物標志物;三是通過與已知毒性藥物的蛋白表達譜進行比較,來預測新化合物的潛在毒性。

蛋白質(zhì)組毒理學研究技術為納米銅毒性作用機制研究奠定了良好的基礎。在肝毒性機制研究方面,Kharbanda K等[12]應用一維與二維分離技術研究了甜菜堿在添加乙醇后對大鼠肝臟的毒效應,結果發(fā)現(xiàn)抗氧化應激功能蛋白碳酸酐酶-Ⅲ的表達量減少,提示甜菜堿在添加乙醇后可能會引起肝臟的氧化應激效應。Kling P等[13]研究了溴化阻燃劑(BFRs)六溴環(huán)十二烷(HBCD)與四溴雙酚A(TBBPA)亞致死劑量下對斑馬魚肝細胞的毒效應,發(fā)現(xiàn)BFRs對斑馬魚肝細胞的毒性機制與氧化應激、能量代謝、信號傳導及細胞凋亡等有關。

在腎毒性機制及生物標志物研究方面,Malard V等[14]應用2-DE聯(lián)合SDS-PAGE-LC-MS/MS技術,研究了硝酸鈾酰對大鼠腎臟的毒效應機制,結果從尿樣中分離鑒定出14種受調(diào)控蛋白(7種上調(diào)/7種下調(diào)),Western blot驗證了3種,其中白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)可引起腎小球滲透性的缺失,表皮生長因子(EGF)下調(diào)與維生素D-結合蛋白上調(diào)可引起腎小管的損傷,提示硝酸鈾酰對腎臟的毒效應可能與腎小球滲透性缺失、腎小管損傷以及金屬脅迫等有關。Dedieu B等[15]應用固相金屬親和色譜(IMAC)技術,從培養(yǎng)的人腎-2可溶性細胞中提取得到UO2+親和蛋白,通過納升級電噴霧液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(nano-LC-ESI-MS/MS)技術分析鑒定出64種功能各異的蛋白質(zhì),并進行生化特性分類:①蛋白質(zhì)表面存在鈾螯合殘留物;②蛋白質(zhì)表面存在路易氏陽離子固定親和力;③蛋白質(zhì)中存在鈾親和性的含磷化合物。這些UO2+親和蛋白的特點為今后尋找鈾離子靶蛋白提供了很好理論依據(jù)。

在生態(tài)毒性機制研究方面,Martins J C等[16]應用MALDI-TOF-MS等技術研究了銅綠微囊藻毒素對河蜆鰓組織蛋白質(zhì)表達的影響,結果發(fā)現(xiàn)纖維形成性膠原蛋白α鏈與肌動蛋白亞型的表達量上調(diào),細胞骨架蛋白β-微管蛋白與肌動蛋白-1的蛋白表達量下調(diào),表明銅綠微囊藻毒素對河蜆鰓組織的毒作用機制可能與破壞細胞結構及影響細胞代謝有關。Mezhoud K等[17]應用差異蛋白質(zhì)組學與差異磷酸化蛋白質(zhì)組學技術研究了微囊藻素-亮氨酸-精氨酸(MC-LR)對稻田魚肝臟的早期毒效應,發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸羥化酶(PAH)及角蛋白的磷酸化水平發(fā)生變化;細胞骨架結構組裝、細胞信號傳導、氧化應激以及細胞凋亡等相關蛋白的表達水平也發(fā)生變化,提示MCs對稻田魚的肝毒性是一個復雜的病理變化過程。Ling X P等[18]應用2D-PAGE聯(lián)合肽質(zhì)量指紋(PMF)與數(shù)據(jù)庫分析技術,研究了急性鎘中毒(AC)對牙鲆鰓組織蛋白表達的影響,發(fā)現(xiàn)了與AC毒作用程度平行表達的HSP70及鈣結合蛋白,認為其可以作為水生動物鎘接觸水平以及人體危險性評價的生物標記譜。Choi J等[19]應用生態(tài)蛋白質(zhì)組學技術驗證了血紅蛋白(Hb)可以作為鎘對搖蚊雀麥生態(tài)毒性的生物標志物。

體外試驗方面也有研究報道,如Kellmann R等[20]將培養(yǎng)的人神經(jīng)纖維瘤細胞暴露于15 mmol/L原多加酸貝類毒素(AZA-1)12 h后對其蛋白表達情況進行分析,發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白與細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白的表達量增加,凋亡調(diào)控蛋白BAX輕微上調(diào);與蛋白質(zhì)生物合成及修飾、核苷酸代謝等有關的mRNA剪接/轉(zhuǎn)錄因子表達量減少,表明AZA-1的毒作用機制可能與干擾細胞的能量代謝以及引起細胞骨架結構的變化等有關。

在藥物毒性機制方面,Park Y K等[21]應用蛋白質(zhì)組學技術研究了霉酚酸(MPA)所誘導的β-細胞毒性機制,結果發(fā)現(xiàn) RhoGD-1α/JNK信號通路在MPA所誘導的胰島素分泌細胞凋亡中起著非常重要的作用。Andringa K等[22]應用蛋白質(zhì)組學技術對APAP所引起的肝臟線粒體毒性機制進行了探討,結果發(fā)現(xiàn)生酮作用調(diào)控酶3-羥基-3-甲基戊-乙酰輔酶A合成酶(HMG-CoA synthase)2的巰基化水平及活性明顯減低、過氧化氫酶被巰基化修飾以及酪氨酸殘基的硝化等,表明某些蛋白質(zhì)的巰基化與硝化修飾可能在APAP所引起的肝毒性中起著重要的作用。Eatima N等[23]應用 Label-Free聯(lián)合nano-MS/MS技術對塞來西布處理前后家族性腺瘤息肉(FAP)病人血清樣本的差異蛋白進行了分析,分離鑒定出83種差異表達,通過鳥槍法(shot-gun)篩選出與信號傳導及心血管病理相關的蛋白質(zhì)作為塞來西布的安全性評價指標及其對FAP的藥效指標。Caldas-Lopes E等[24]研究了 HSP90阻止劑PU-H71對三陰乳腺癌(TNBCs)的效應,發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖、生存及擴散性相關蛋白Ras/Raf/MAPK通道蛋白與G2-M期調(diào)控蛋白等均不同程度減少,說明HSP90可以作為乳腺癌的一個治療靶標。

在神經(jīng)毒性機制方面,Lopachin R M等[25]通過計算親電子體與其嗜酸性靶標相互作用的量子力學參數(shù)對HNE的突觸毒性進行了研究,發(fā)現(xiàn)HNE主要是與神經(jīng)遞質(zhì)中的巰基硫醇形成加合物而引起神經(jīng)末梢毒性。Tshala-Katumbay D等[26]應用 2-DIGE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS技術分別對經(jīng)2,5-HD與1,2-DAB處理過的SD大鼠腰骶叢差異表達蛋白進行了分析,發(fā)現(xiàn)兩個處理組的神經(jīng)纖維三聯(lián)體 L、膠溶素、蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶、GST、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原型)脫氫酶1α、丙酮酸激酶、脂肪酸合酶等均存在差異性表達,表明2,5-HD與1,2-DAB引起的軸突毒性具有共同的生物標志物或相同的神經(jīng)毒作用機制。Yin G N等[27]在LC-MS/MS、2D-GE以及 Western blot等技術的基礎上,通過共培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞與成神經(jīng)細胞瘤,發(fā)現(xiàn)可溶性CD14蛋白可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的神經(jīng)毒性,從而認為可溶性CD14蛋白或許可以作為 PD與AD的候選腦脊液(CSF)生物標志物。

以上研究技術為納米銅的肝毒性、腎毒性、生態(tài)毒性、藥物毒性、神經(jīng)毒性及體外毒性機制研究和生物標志蛋白篩選提供了成熟的研究思路。

5 納米銅應用及研究中存在問題和展望

納米銅的誕生給未來的飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)帶來技術上的革命。但其特殊的理化性質(zhì)給人類健康、環(huán)境和生物安全,以及傳統(tǒng)的毒理學研究手段提出了巨大挑戰(zhàn)。納米銅應用存在的主要問題是:納米銅會不會對人體有害,其生產(chǎn)、使用過程會不會對大氣、水體、土壤、生物鏈以及整個生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響,因此,當務之急是開展納米銅危害確認、暴露評價、危險度和安全性評估。納米銅的一般毒性研究較多,系統(tǒng)毒理學研究幾乎是空白。組學技術的應用為納米銅毒性研究創(chuàng)造了良好的契機,加強納米銅肝毒性、腎毒性、生態(tài)毒性、藥物毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性及體外毒性蛋白組學研究是納米銅系統(tǒng)毒理學研究主要內(nèi)容。毒理蛋白質(zhì)組學同樣具有蛋白質(zhì)組學技術(尤其是電泳分離技術)重復性差的特點;研究對象多是分離的樣本,原位組織研究方面才剛剛開始,有待于進一步的發(fā)展。綜上所述,從蛋白水平上闡明納米銅的毒性作用機制,為人類食品安全、納米獸藥飼料添加劑的研發(fā)、同類納米金屬材料的研究提供依據(jù),對推動我國在納米科技領域的健康和可持續(xù)性發(fā)展有重要意義。

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Progress on Nano-copper Toxicity

LI Xia1,LIU Yong-ming1,QI Zhi-ming1,DONG Shu-wei1,LIU Shi-xiang1,WANG Sheng-yi1,WAN Yu-lin2,LIU Xu3

(1.Lanzhou Institute of Animal Sciences and Veterinary Pharmaceutics of CAAS,Lanzhou,Gansu,730050,China;2.China Agricultural Veterinary Biology Science and Technology Company Limited,Lanzhou,Gansu,730046,China;3.Gansu Province Centre of Disease Prevention and Control in Animal,Lanzhou,Gansu,730046,China)

s:It has brought a technological revolution of the birth of nano-copper to the development in the field of animal husbandry and veterinary medicine,feed industry and aquaculture industry.However,nano-copper caused severe damage to human health and ecosystems due to the unique nano-effects,meanwhile its biological safety data are extremely scarce,so we must strengthen its risk assessment.This paper introduced the concept of nano-materials,nano-copper,basic features and application.It summarized that the general toxicity of nano-copper,the advantages and disadvantages of research methods between traditional and system of toxicology,the nano-technology problems,simultaneously the nano-materials research trends were prospected.It may provide the basis for healthy and sustainable development of nanotechnology.

nanometer material;nano-copper;toxicity;proteomics

S856.9

A

1007-5038(2010)08-0074-05

2009-11-11

國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A05-06);中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所基金(BRF20070303)

荔 霞(1977-),女,甘肅徽縣人,助理研究員,博士研究生,主要從事動物營養(yǎng)代謝病與中毒病、獸醫(yī)毒理學及中獸藥新制劑研究。