噬菌體生物擴增法對結核病臨床診斷的意義

張周云，熊國亮

(江西省胸科醫院檢驗科，江西南昌 330006)

結核病是嚴重危害人類身體健康的全球性傳染性疾病，我國結核病的發病率和病死率均較高，結核病的早期診斷和有效治療是結核病疫情控制的關鍵。因此，尋找快速、準確可靠、陽性率高的檢測方法是實驗室研究的重要課題。為此我們應用噬菌體生物擴增法檢測結核病的臨床標本，并評價其對結核病臨床診斷的應用價值，為結核的快速診斷提供新的檢測手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 ①結核組：2007年6月至2008年10月為我院86例活動性肺結核患者痰標本、73例結核性胸膜炎患者胸水、30例肺結核患者肺泡灌洗液，共計189份臨床標本，其中男121例、女68例，平均年齡46.3歲。②非結核組：7例COPD急性發作、3例急性支氣管炎患者痰標本，5例肺癌患者胸水，5例塵肺患者肺泡灌洗液，共計20份非結核患者標本，其中男12例、女8例，平均年齡56.1歲。

1.2 試劑 (1)噬菌體檢測試劑：分枝桿菌噬菌體D29、指示細胞(恥垢分枝桿菌)、液體培養基、噬菌體殺毒劑(硫酸亞鐵胺)由英國BIOTEC Laboratories公司提供。(2)改良羅氏培養基按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[1]自配。

1.3 方法

1.3 .1 噬菌體生物擴增法 按照FASTPlaque-TBTM試劑說明書配制所需試劑，包括痰、肺泡灌洗液等標本處理液，培養基，噬菌體，敏感細胞等，所有操作均在無菌條件下進行。①標本的前處理：待檢痰標本、肺泡灌洗液先用3%NaOH溶液消化20min，再加磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)離心20min，棄上清液；胸水標本4000r/min、離心10min，棄上清液，沉淀加1～2ml 3%NaOH混勻去污染10min，4000r/min、離心10min，棄上清液；腦脊液直接離心去上清液。②用液體培養基洗滌以上沉淀物2次，最后加入1ml液體培養基重懸沉淀物(確保打散)，無菌條件下轉移至反應管中為備用待檢菌液。③取噬菌體0.1ml與待檢菌液充分混勻，37℃孵育1h后加入0.1ml噬菌體殺毒劑，混勻，至室溫5min后加入5ml液體培養基和1ml指示細胞，顛倒混勻一次。上述混合培養液與5ml已溶解瓊脂液(55±2℃)混勻后立即傾入無菌平皿中，旋轉混勻，待凝固成形后，平放于37℃培養箱中培養18～24h判讀結果，每次檢測要同時設陽性對照和陰性對照平皿。④結果觀察：在各對照組結果正確的條件下，觀察檢測標本結果。陽性平皿中可見大小數量不等的透明狀噬菌斑、或許多噬菌斑相互融合成透明狀；陰性結果可見指示細胞在瓊脂培養基中均勻分布、無噬菌斑出現。⑤結果判定：陽性結果≥20個噬菌斑；陰性結果＜20個噬菌斑。

1.3 .2同份標本同時進行離心涂片抗酸染色鏡檢，改良羅氏培養，其操作方法按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[1]進行。

2 結果

2.1 三種方法對189例臨床標本檢出的陽性率分別為：噬菌體生物擴增法52.91%(100/189)；涂片抗酸染色15.34%(29/189)；羅氏培養27.51%(52/189)。噬菌體生物擴增法與涂片抗酸染色和羅氏培養陽性檢測率比較，統計學有顯著差異(χ2=59.32、P＜0.005，χ2=25.35、P＜0.005)。 結果詳見表 1。

表1 三種方法對189例各類臨床標本的檢測結果

2.3 20例非結核患者標本噬菌體生物擴增法，涂片抗酸染色，羅氏培養均未檢測出陽性。

3 討論

3.1 目前，結核病的診斷方法很多，抗酸染色涂片法是目前最廣泛采用方法之一，該方法檢測速度快，價格低廉，能檢出含菌量較高的標本，但對含菌量較低的胸腔積液、腦脊液等標本的檢出率相對較低，無法早期診斷結核病。羅氏培養的陽性率雖高于涂片法但培養時間很長，難以達到臨床上需要快速檢測的目的。

3.2 近年來分枝桿菌噬菌體結核病快速診斷的研究報道很多[2～4]，該方法的基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，未進入感染菌體內的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，已進入菌體內的噬菌體不受影響，噬菌體在感染菌體內大量增殖，并將菌體裂解，釋放出的子代噬菌體可感染隨后加入的指示細胞，并將其裂解，在瓊脂平板上出現透亮的噬菌斑，因此，只要根據噬菌斑的有無即可判斷待檢標本中是否存在活的結核分枝桿菌，整個檢測時間只需2天。本實驗資料對189例臨床結核標本進行檢測結果：噬菌體生物擴增法陽性率52.91%(100/189)，遠高于涂片抗酸染色陽性率15.34%(29/189)和羅氏培養陽性率27.51%(52/189)；特異性為100%。涂片抗酸染色和羅氏培養的陽性檢出率都集中在痰液和肺泡灌洗液標本，但噬菌體生物擴增法不僅對痰液、肺泡灌洗液標本有較高的檢出率而且對結核性胸膜炎患者胸水標本也有較高的檢出率(49.30%)。

綜上所述，噬菌體生物擴增法檢測對結核病診斷具有快速、特異性和敏感性高的優點，該方法能為結核的快速診斷提供新的檢測手段，并具有推廣的應用價值。

[1]中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):28～31.

[2]McNerney R.TB:The return of the phage.A review of fifty years of mycobacteriophage research[J].Int Jtuberc Lung Dis,1999,3:179～184.

[3]靳安佳,王 潔,胡忠義，等.噬菌體生物擴增法檢測肺結核患者痰標本臨床應用研究[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(8):807～808.

[4]四種檢測方法對結核病臨床診斷價值的探討[J].中華檢驗醫學雜志,2007,30(7):742～745.